萊菔硫烷誘導人肝癌HepG－2細胞凋亡的JNK途徑

鄒 翔，曲中原，白 晶，季宇彬，

(1.哈爾濱商業大學 生命科學與環境科學研究中心，哈爾濱 150076;2.國家教育部 抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱 150076;3.哈爾濱商業大學中藥學博士后流動站，哈爾濱 150076)

西蘭花(Broccoli)卓越的防癌抗癌作用歸因于其富含異硫氰酸鹽類物質，而萊菔硫烷(sulforaphane，SFN)是其中最主要的活性成分之一［1－5］.以往研究表明，SFN可通過完全抑制I相酶，并且誘導II相解毒酶的表達而預防化學物誘發的肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、直腸癌等多種癌癥的發生［6－7］.近年來研究發現，SFN 可通過誘導 HepG－2細胞發生G2/M期阻滯，并通過啟動線粒體途徑誘導人肝癌HepG－2細胞凋亡，發揮抗肝癌作用［8－9］.本文主要在考察 SFN 誘導 HepG－2細胞凋亡作用的基礎上，研究SFN對人肝癌HepG－2細胞中JNK和p－JNK蛋白表達的影響，探討JNK信號轉導途徑在SFN誘導HepG－2細胞凋亡中的作用.

1 材料與方法

1.1 細胞

人肝癌HepG－2細胞株，由哈爾濱商業大學藥物研究所博士后科研工作站傳代保種.

1.2 藥品和試劑

萊菔硫烷(分子式C6H11NOS2，相對分子質量為 177.3，純度98.3%)，美國 Alexis公司，用前以二甲基亞砜(DMSO)溶解，－20℃保存，臨用時加培養液稀釋至所需濃度，使DMSO終質量分數不超過0.1%;阿霉素(批號080907)，浙江海正藥業股份有限公司;RPMI－1640培養基干粉，美國GIBCO公司;胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)，美國Sigma公司;Hoechst 33258:Sigma公司;鼠抗JNK/SAPK抗體、鼠抗p－JNK/SAPK抗體、堿磷酶標記馬抗鼠IgG，碧云天公司;其他試劑均為國產分析純.

1.3 實驗儀器

CO2培養箱，日本Sanyo公司;低溫高速離心機，美國Beckman－Coulter公司;熒光顯微鏡:日本Olympus公司;水平電泳儀、電轉儀，美國Bio－Rad公司;超凈工作臺，蘇凈集團.

1.4 細胞培養

人肝癌細胞系HepG－2常規細胞復蘇后，培養于含有10%胎牛血清RPMI－1640培養液中，置于CO2培養箱(37℃，體積分數為5%的CO2，相對濕度95%)培養.2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞進行實驗.

1.5 熒光顯微鏡觀察凋亡細胞形態

先將6孔培養板內放上蓋玻片，取對數生長期細胞接種于6孔培養板中，細胞濃度為3×105個/mL，置培養箱中37℃、5%CO2培養24 h后加入不同濃度的SFN(使其終濃度分別10、20、40μmol/L)，陽性對照組加 ADR(終濃度 0.5μmol/L);陰性對照組加相同體積的培養液.48 h后細胞用胰酶消化，加PBS洗1次，加入固定液(甲醇和冰醋酸的體積比為3∶1)，4℃固定10min后，加入質量濃度為5mg/L的熒光探針Hoechst 33258，置于37℃，5%CO2培養箱中孵育15min，將孔中的蓋玻片取出，蓋在已滴好甘油的載玻片上，置于熒光倒置顯微鏡上觀察細胞形態并照相.

1.6 Western blotting法檢測細胞內 JNK和 p－JNK蛋白的表達

將對數生長期細胞用胰酶消化后，傳代培養于細胞培養瓶，24 h貼壁后給藥.各給藥組設計為:給藥組(SFN 終濃度 10、20、40μmol/L)、對照組(加等體積 RPMI 1640)、阿霉素組(終濃度0.5μmol/L).48 h后，收集細胞，用預冷的 PBS洗2次、離心，加入裂解液冰上裂解1.5 h，4℃、12000 r/min離心10min提取總蛋白.570 nm處測定吸光度，計算蛋白含量，并用細胞裂解液將各樣品調至相同濃度.配制5%的濃縮膠及12%的分離膠進行 SDS－PAGE電泳.電泳條件:濃縮膠80 V，待樣品前沿進入分離膠后調電壓至100V.轉膜條件:200 mA恒流轉膜60min.將凝膠中的蛋白轉移到NC膜上，5% 脫脂奶粉封閉2 h，加一抗過夜.次日，取出NC膜用TBST緩沖液充分振搖洗膜3次，每次10min.加堿磷酶標記馬抗小鼠IgG室溫孵育2 h后，TBST振搖洗膜3次，每次10min.加顯色液顯色，Tannon凝膠成像系統照相.掃描圖像在天能GIS凝膠成像分析系統進行量化分析.

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 SFN對HepG－2細胞凋亡的影響

實驗結果如圖1所示.不同濃度SFN作用于HepG－2細胞48 h后，熒光顯微鏡下可見隨著藥物濃度的增大，凋亡細胞數量逐漸增多，細胞出現核染色質固縮濃集，同時伴有凋亡小體的形成.而空白對照組細胞胞核呈均勻藍色，無深染的亮點，表明染色質均呈均勻分布.

圖1 熒光顯微鏡觀察SFN對HepG－2細胞凋亡的影響

2.2 SFN對人肝癌HepG－2細胞內JNK和p－JNK蛋白表達的影響

實驗結果如圖2－5所示.結果表明，隨著SFN濃度的增加，HepG－2細胞內JNK蛋白表達并無明顯變化，而p－JNK蛋白表達逐漸增加，各組與對照組比較，差異均具有統計學意義(P＜0.05或P ＜0.01).

3 討論

近年來，國內外對于SFN防癌抗癌的作用及機制進行了較為深入研究，已成為熱點研究問題.本論文前期研究發現，SFN可通過誘導人肝癌HepG－2細胞發生G2/M期阻滯和凋亡發揮抗肝癌作用，其機制可能是:1)SFN可通過下調HepG－2細胞內Cdk1和CyclinB1蛋白的表達、上調p－Cdk1的表達抑制Cdk1－CyclinB1復合物的形成和活化而將HepG－2細胞阻滯于G2/M期;2)SFN可下調Bcl－2基因表達、上調Bax基因表達，進而誘導線粒體通透性轉變孔道(PT孔道)的開放，促進線粒體內Cyt－c向胞漿的釋放;釋放的Cyt－c進一步與 Apaf－1、procaspase－9結合形成凋亡體，活化的 caspase－9進一步激活下游的caspase－3，最終完成 SFN通過線粒體途徑誘導HepG－2 細胞的凋亡過程［7－9］.而本課題采用熒光顯微鏡也證實，SFN可誘導HepG－2細胞發生凋亡，并呈現一定的劑量依賴性.

對于MAPK信號轉導通路而言，在大多數情況下，JNK信號傳導途徑在細胞應激反應中的作用具有復雜性、多樣性的特點，被激活后可促進細胞凋亡的發生，具體機制與誘導FasL和TNFR1的表達、調控凋亡相關基因的差異表達及激活Caspase家族有關.有研究表明，魚藤酮誘導的SH－SY5Y細胞凋亡中，JNK的磷酸化狀態被大大加強，并且是Caspase依賴性的，說明魚藤酮誘導SH－SY5Y細胞凋亡，是通過激活JNK通路，進而通過Capase家族起作用的.在Fas介導的細胞凋亡中，JNK起到了重要作用.在 Fas激活 Caspase后，活化的Caspase裂解JNK的上游調控分子MEKK1，進而激活 JNK 通路誘導凋亡［10－11］.而本研究發現，SFN可上調p－JNK蛋白的表達進而激活JNK信號通路，這可能是其誘導HepG－2細胞凋亡的主要機制之一，但結合已有研究我們發現，除了線粒體通路外，死亡受體通路可能也參與了SFN誘導HepG－2細胞凋亡的過程，但該方面的研究還有待進一步證實.

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