高質量加工番茄基因組DNA提取方法的改進

張 楠，謝 放

（蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅 蘭州 730070）

目前選育高品質植物品種主要采用的是分子標記輔助育種方法，因而怎樣獲得高質量的基因組DNA用于后續的分子標記將顯得非常關鍵。番茄中含有較多的多糖和其他次生代謝產物（酚、酯、萜、色素等）[1]，這給高質量的DNA提取帶來較多的困難。尤其是多糖、色素、蛋白質成分是影響DNA純度最常見的問題。如何做到在去除污染物又能相對保持高的產量的同時，對大批量的模板進行提取，一直是像番茄這類含多糖、色素和鹽類物質較多的植物所探討的問題。

在加工番茄分子標記輔助育種時，多采用CTAB法[2]、SDS法及DNA試劑盒[3-4]等提取番茄DNA，效果均不太理想。通過試驗比較多種提取方法，得到一種適用于提取大批量加工番茄DNA的方法——改進CTAB法。通過此法克服了番茄中富含多糖、蛋白質、酚和色素的影響，所得DNA通過凝膠電泳和分子標記均獲得了滿意的結果，可以將此方法在富含上述物質的植物中推廣使用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

加工番茄葉片于2010年7月采摘于蘭州交通大學科技園試驗田。將采摘的幼嫩葉片和老葉片分別裝入塑料袋置于冰盒中帶回實驗室，置于-20℃備用。

1.2 藥品與試劑

引物序列：隨機引物S636（GGGATATCGC），ISSR 引物 855（ACACACACACACACACYT）上述引物由上海生工生物工程公司合成。

CTAB 提取液：含 2%CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.2%β-巰基乙醇，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCL pH 值 8.0，PVP，10 mg/mL RNase；TE 緩沖液：含 10 mmol/L Tris-HC1，l mmol/L EDTA（pH 8.0）；飽和酚∶氯仿∶異戊醇（V∶V∶V）=25∶24∶1，氯仿︰異戊醇（V∶V）=24∶1；50×TAE 緩沖液：1 L 緩沖液中含有242.0 g Tris堿，57.1 mL冰乙酸，200 mL 0.5 mol/L EDTA，pH 值 8.0。

1.3 儀器

TGL-20M高速冷凍離心機（湖南湘儀）；紫外分析儀（北京六一儀器廠）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；PCR擴增儀（Biometra）；HH-2恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；UVP凝膠成像系統（USA）。

1.4 DNA的提取

（1）取番茄葉片2～3片放入研缽中，加入液氮，迅速研磨成粉末，稱取約0.2 g粉末，快速裝入5 mL離心管中；（2）加入850 μL預熱CTAB提取緩沖液，65℃水浴40 min，冷卻至室溫；（3）加入等體積的Tris-飽和酚：氯仿：異戊醇（V25∶V24∶V1）輕震搖勻后，4℃、12 000 g離心 10 min；（4）取上清液，加入10%體積3 mol/L NaAc溶液搖勻后再加入等體積的氯仿-異戊醇（V24∶V1）輕震搖勻后，4℃、12 000 g離心10 min；（5）取上清液，加入2倍體積的冰凍無水乙醇，冰浴20 min，用無菌牙簽將絮狀物挑出放入新管；（6）70%乙醇（體積分數）漂洗沉淀兩次，37℃烘干，溶于60 μL TE緩沖溶液中，4℃保存備用。

1.5 DNA的檢測

從提取的DNA液中吸取10 μL，用TE溶液定容至2 000 μL，在紫外分光光度計下測OD260，OD280值，并計算OD260/OD280，跟據公式 [DNA濃度（μg/mL）=50×OD260×稀釋倍數）]計算 DNA 濃度；稱取0.2 g瓊脂糖加人25 mL的1×TAE緩沖液，經微波爐加熱溶解，待其不燙手時加入0.2 μL EB（10 mg/mL）即用含EB的0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取的 DNA，每孔點樣 4 μL（3 μL DNA 樣品+1 μL 上樣緩沖液），電壓80V，電泳40 min。

1.6 PCR擴增

采用25 μL擴增體系，以隨機引物S636和ISSR引物855分別作為單引物，隨機擴增體系組成參見楊永超等[5]的方法，ISSR擴增體系參見朱為民等[6]的方法。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，5 V/cm，1 h。

2 結果與分析

2.1 DNA溶液吸光值、濃度及電泳檢測

當OD260/OD280值在1.7～1.9時說明所提取的DNA質量較好，比值小于1.7可能有蛋白污染，比值大于2.0，說明有RNA污染或DNA已經降解。幼嫩葉片和老葉片所提取DNA溶液經紫外分光光度計測定260 nm和280 nm處的吸光值并計算OD260/OD280，其值在1.75～1.91之間，計算得DNA濃度為在40～80 ng/L，并結合電泳圖譜得出所提DNA純度較高，RNA和蛋白質含量較少，無降解，根據計算將DNA濃度調整為20 ng/μL，于－20℃貯存備用。

圖1 總DNA電泳檢測

2.2 PCR擴增結果

采用RAPD隨機引物和ISSR引物對隨機提取的兩個老幼葉片的DNA模版進行PCR擴增然后進行電泳檢測（圖2、圖3）。從結果來看采用兩種分子標記均能擴增出清晰、無拖尾的電泳圖譜，說明用此法所提取的加工番茄DNA在結構上具有完整性；加樣口無亮帶，說明所得的DNA溶液較純，無其他糖類、酚類、色素等雜質，適合RAPD和ISSR等分子標記試驗。

圖2 用RAPD引物對DNA模板質量進行PCR擴增檢測

圖3 用ISSR引物對DNA模板質量進行PCR擴增檢測

3 討論

植物組織在生長中隨著生長階段的不同所富含的多糖、酚類和色素含量各不相同[1]。本研究通過提取出番茄幼嫩葉片和老葉片中的DNA經紫外、電泳和PCR擴增檢驗表明純度高、無雜質存留，DNA片段完整，不需進一步純化即可用于分子標記試驗。本法與以往的提取方法相比，具有以下特點：第一，采用冷藏和液氮研磨的方式最大程度的避免了葉片細胞中DNA的降解，保證了所提DNA的質量和片段的完整性。第二，在提取緩沖液中加入防止酚類氧化與易與酚類結合的試劑β-巰基乙醇和PVP（聚乙烯吡咯酮），防止了酚類與DNA的結合。第三，采用tris-飽和酚-氯仿-異戊醇，氯仿-異戊醇相結合的抽提法更有效地去除了蛋白質和酚類的殘留。第四，通過加入3 mol/L NaAc能明顯溶解脂溶性色素和多糖，隨后經冰凍無水乙醇沉降和70%乙醇多次洗滌能有效達純化DAN的目的。同時，應用此法也成功提取了西瓜和甜瓜的DNA。此外，可采用老葉片進行DNA的提取，本法對于在植物分子標記輔助育種過程中獲得種子很少的品種，解決了傳統方法通過黃化苗和幼苗提取DNA所面臨材料短缺的問題。

[1] 霍 鋒，張 瀧，張 婭.DNA分子標記技術在藥用植物鑒別中的應用[J].安徽農業科學，2010，（8）：4089-4091.

[2] 路 盼，康立功，許向陽，等.3個番茄品種及其6份親本材料指紋圖譜的構建[J].中國瓜菜，2010，23（3）：6-10.

[3] 高永利，李景富，王傲雪，等.番茄RAPD反應體系的優化[J].東北農業大學學報，2007，38（2）：175-180.

[4] 董坦坦，姬長英，周 俊，等.成熟番茄的圖像識別及其位姿的獲取研究[J].江西農業學報，2009，21（8）：152-155.

[5] 鄧正春，肖清平，覃事玉，等.影響番茄雜交制種產量的因素分析[J].湖南農業科學，2010，（7）：21-22，25.

[6] 朱為民，王曙霞，楊少軍，等.番茄ISSR-PCR反應體系的優化[J].上海農業學報，2007，23（3）：5-8.