豬胸膜肺炎放線桿菌16S rDNA基因的克隆及序列分析

沈 萍，王喜軍

（1.湖南生物機電職業技術學院動科系，湖南 長沙 410127；2.長沙市動物防疫監督站，湖南 長沙 410012）

豬胸膜肺炎放線桿菌（APP）為革蘭氏陰性桿菌，可引起豬傳染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumoniae，PCP），該病由 Pattison 首次報道，現已在美國、墨西哥、瑞士、丹麥、澳大利亞、加拿大、泰國、韓國、日本等國家廣泛流行[1-2]；該病在我國也早已廣泛存在，并有擴大蔓延之勢。APP血清型較多，我國豬場中存在的就有 3、5、7、8、10 型，其中以3型和7型為最多[3]。發病時，病豬出現心衰和循環障礙，精神委頓，食欲廢絕；晚期出現嚴重的體溫下降和呼吸困難；臨死前從嘴、鼻孔流出血性泡沫樣液體。病豬于發病后24～36 h內死亡，死亡率高達80%～100%[4]。

16S rRNA為原核生物的一種核糖體RNA，在漫長的生物進化過程中，因其受到的選擇壓力小，基因序列變化緩慢，可以用來標記生物的親緣關系和進化距離；在結構與功能上具有極為高度的保守性，素有“細菌化石”之稱[5]。鑒于APP有很多血清型，且各血清型之間缺乏相互的交叉保護性，很大程度就是因為其不同血清型的外膜蛋白基因、功能基因存在一定差異，因此，選擇APP的16S rDNA基因設計引物，對在湖南分離到的長沙（CS）株的16S rDNA基因進行了克隆和測序；并與已報道的血清3、5、7型做序列比對，進行同源性分析。為APP分子流行病學調查、親緣性關系的研究提供資料，同時為APP的監控奠定基礎。

1 試驗部分

1.1 材料

1.1.1 病料來源 存于湖南生物機電職業技術學院動科系動物微生物實驗室的豬胸膜肺炎放線桿菌病料。

1.2.1 引物設計 根據GenBank登錄的APP的16S rDNA基因序列，利用生物軟件Primer 5.0，設計1對特異性引物，擴增片段長度為827 bp，由南京金思特生物科技有限公司合成，合成后稀釋為終濃度20 pmol/L，置-20℃保存。

1.2 方 法

初代接種后24 h后加有V因子的副嗜血桿菌疫苗培養基上可觀察到呈圓形、中間有一灰白點、邊緣整齊、表面稍隆起、從針尖大小至直徑3 mm似露珠樣的菌落。顯微鏡下，細菌呈典型的革蘭氏陰性小球桿菌形態，有莢膜，呈長絲狀，有的成雙，有的成團。

使用DNAStar分析軟件中的MegAlign程序，運用Clustal V算法對所測序列與參考序列進行比較并繪制和分析遺傳進化樹，同源性分析表明，分離得到的 4 株 CS1、CS2、CS3、CS4 株同源性為100%，筆者將得到4株共稱為CS株，與國外學者得到的血清3、5、7型同源性為99.4%～99.6%，與丹麥株同源性為100%；與李氏放線桿菌、脲放線桿菌、馬駒放線桿菌、莢膜放線桿菌同源性分別為97.8%、96.3%、97.3%、96.3%（見表1）。

1.1.2 主要試劑 蛋白酶K、Ex Taq酶、10×Mg2+、10×Buffer、dNTP、DL-2000 DNA Marker、瓊脂糖、E.B（寶生物工程（大連）有限公司）；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、TIANgel Midi Purification Kit（天根公司）；X-Gal、pGEM-T easy載體（Promega公司）；工程菌JM109為本實驗室保存；副嗜血桿菌疫苗培養基（長沙佳和生物技術有限公司）。

分離得到的4個湖南CS株均能擴增得到了約842 bp的目的DNA條帶（見圖1），與預期結果相符。

將擴增的目的基因純化與克隆T載體連接，構建重組質粒pMD-T16S rDNA,轉化于工程菌JM109中，取1 μL菌液作擴增模板進行PCR鑒定，均能得到約842 bp的片段（見圖2）。說明目的基因已克隆到載體中。

2 試驗結果

2.1 菌落及細菌形態

1.2.2 細菌的培養 采集病豬的氣管、肺臟的病變組織，用生理鹽水浸泡后涂布于加有V因子的副嗜血桿菌疫苗培養基，37℃燭缸法培養24 h，觀察菌落形態，并取單個菌落革蘭氏染色鏡檢觀察后保存。

2.2 分離株的PCR鑒定

1.2.4 pMD18-T載體克隆與序列測定 將純化產物按常規方法連接到pGEM-T中，轉化于工程菌JM109中，取50 μL轉化菌液均勻涂布于含氨節青霉素的LB平板，37℃培養16 h。培養后挑選白色的單菌落，對菌落進行PCR鑒定，陽性的克隆由南京金思瑞生物有限公司測序。應用DNAStar分析軟件對測定的App 16S rRNA基因序列進行分析和同源性分析，序列比較參考株毒株名（登錄號）為：AF033059、CP000569、CP000687、CP001091、M350-17、M75067、M75072、M75075。

圖1 16S rRNA基因的擴增

2.3 重組質粒菌落的PCR鑒定

F：5-GGAGCTTGCTTTCTTTGCCGACG-3；R：5-TAACCTTGCGGCCGTACTCCC-3。

圖2 陽性重組質粒的PCR鑒定

2.4 測序結果分析

依據所建立的放線桿菌系統發育樹（見圖3），除去外群，CS株與丹麥株（AF033059）的遺傳距離最近，而且與血清3、5、7型處于一個相近的分支上。

2.5 系統進化樹分析

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表1 核昔酸序列同源性分析

圖3 系統發育樹放線的基礎上的16S rRNA基因核苷酸序列

3 討論

豬傳染性胸膜肺炎是侵害豬呼吸道的主要傳染病之一，對養豬業危害極其巨大。該病是一種急性或慢性呼吸道疾病，以肺部纖維素性、壞死性和出血性肺炎為特征，具有高度的傳染性，各種年齡的豬對該病都為易感。國內外對其4種毒素因子ApxI[6]，ApxII[7]，ApxIII[8]和 ApxIV[9]研究較多，主要集中于其抗原活性的研究；而本研究選取了APP的16S rDNA基因為研究對象，填補了國內APP基因分析的一個空白，因為單純按照細菌的形態和生化指標等特征，已經難以區分比如豬胸膜肺炎放線桿菌、李氏放線桿菌、脲放線桿菌、馬駒放線桿菌、莢膜放線桿菌這樣的親緣關系相近的菌株，不能保證分類的準確性和科學性。

目前，16S rDNA已被作為一個分子指標，廣泛地應用于各種細菌的系統進化分析和分子差異的研究。這是因為16S rDNA普遍存在于一切細菌內，生理功能穩定，非常保守，具有良好的時鐘性質，可用它比較在進化中的相互關系[10]；而且大量已知細菌的16S rDNA序列都被測定并上傳至Gen－Bank，使細菌鑒定和分類擁有了非常有用的參照系統。人類對自然界存在的微生物多樣性的認識還遠遠不夠，在今后相當長的時間內以16S rDNA基因為基礎的群落結構研究方法仍然是揭示和明確環境微生物群落結構的主要手段。本研究獲得的豬胸膜肺炎放線桿菌CS株與李氏放線桿菌、脲放線桿菌、馬駒放線桿菌、莢膜放線桿菌同源性分別為97.8%、96.3%、97.3%、96.3%，都高于95%，與16S rDNA序列的相似性已成為劃分屬的標準，屬內同源性應不低于95%這是一致的[11]。

朱小寧等[12-14]曾應用16S rDNA基因分離鑒定了副豬嗜血桿菌獲得成功。本研究應用16S rDNA作為放線桿菌的一個分子指標，結果提示分離得到的A.pleuropneumoniae CS株與國內早期報道的存在A.pleuropneumoniae血清3、5、7型處于一個相近但不同的分支，提示國內存在除血清3、5、7型外的A.pleuropneumoniae病原存在。研究結果為進一步開展分子流行病學調查及相關疾病的研究提供了依據。

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