茶籽餅降解菌的篩選及降解條件優化與發酵效果的研究

田璨熙，吳永堯，婁立起，周志成

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

我國是世界油茶栽培面積最大，品種最豐富、茶油產量最高的國家。據不完全統計，全國每年產茶籽約6 000萬t，榨油后的茶籽餅在3 500萬t以上[1-2]。過去多用作燃料或肥料，對茶籽餅的綜合利用率較低[3]。據報道,茶油下腳料中茶籽餅粗蛋白含量為12%～16%[4]，粗蛋白中，不僅必需氨基酸含量較其它餅粕高[5]，而且賴氨酸的含量較高[6-7]。說明茶籽餅具有極高的飼料開發價值，對于改良土壤板結、提高土壤肥力等方面也具有很高的潛在利用價值。可見，若能利用科學的方法將對其所含有的粗蛋白成分進行降解利用，茶籽餅的開發利用將變廢為寶，前景誘人。

由于茶籽餅中含有天然的抑菌成分，抗菌作用較強[8]，以致于一般的微生物不能以茶籽餅為底物生長[9]，利用微生物對其進行降解比較困難，目前國內用微生物對茶籽餅進行有效降解的報道較少，因此筆者針對目前國內缺乏對茶籽餅進行微生物降解研究的現狀，對能降解茶籽餅中粗蛋白的菌種進行廣泛篩選，并對菌株發酵條件進行優化，為茶籽餅綜合開發利用提供一定的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株從自然環境中分離篩選；茶籽餅為某茶油廠提供。

富集培養基（g/L）：茶籽餅 30，121℃下滅菌20 min；酪素平板培養基（g/L）：干酪素 10，溶解，加水定容至1 000 mL并調pH值為5；瓊脂2.5%。復篩培養基（g/L）：（a）種子培養基為牛肉膏 5，蛋白胨10，NaCl 5 ，自然 pH 值；（b）搖瓶培養基：茶籽餅40。斜面培養基為另加質量分數為2%瓊脂的種子培養基。

1.2 方 法

1.2.1 篩選方法 將采集的土壤和水樣等樣品按質量分數4%的接種量分別接種到富集培養基37℃條件下振蕩培養3 d。利用蛋白酶對酪素的水解作用進行平板法篩選，將初篩后的活性單菌落菌置于4℃冰箱種斜面保存，用于進一步復篩。

將初篩的菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養基中培養24 h后，接種于含6%的茶籽餅的復篩搖瓶培養基中振蕩培養3 d，進行復篩。

1.2.2 分析方法 分析方法分為如下幾個部分。（a）降解菌篩選方法。初篩用水解圈法對將接種于富集培養基中培養3 d后菌落進行多次平板劃線純化并保留；將初篩菌置于搖瓶中發酵通過酶活及生物量測定進行復篩。（b）粗酶液制備。供試菌株搖瓶發酵液經紗布過濾后，8 000 r/min離心20 min，收集上清液。（c）游離氨基酸含量測定。用茚三酮法[10]。（d）蛋白酶活力的測定.福林酚法測定[11]。酶活力定義為1 mL液體酶在40℃和pH 9的條件下1 min水解酪素產生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位，以U/mL表示。（e）生物量的測定。平板菌落計數法及比濁法[12]。（f）降解率的測定。用凱式定氮法[13]將發酵前后底物經三氯乙酸浸泡處理12 h后過濾，棄上清液，對發酵前的粗蛋白含量與發酵后的粗蛋白含量分別進行測定：

降解率=[（發酵前粗蛋白含量-發酵后粗蛋白含量）/發酵前粗蛋白含量]×100%

1.2.3 培養基及條件的優化 保持基礎培養基其它條件不變，依次改變培養基的茶籽餅質量分數、碳源和無機鹽種類，等量接種T7菌懸液4 mL，37℃，裝液量為100 mL/250mL，150 r/min搖床養48 h，通過對發酵液中蛋白酶活性及生物量測定來進行單因子優化。

在確定最佳茶籽餅質量分數，碳源和無機鹽后，以初始pH值，接種量，溫度，麥芽糖含量為對象，通過極差分析來確定最佳的培養條件，因素水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平

1.2.4 發酵周期的測定 將菌株接種于上述最佳培養基及培養條件下搖瓶發酵，在培養24 h后每隔12 h取樣測定其蛋白酶活力，生物量作圖分析。1.2.5 降解菌的評價 將經篩選后的出發菌株及大豆粕高效降解菌M1，DB2[14]分別接種于底物為9%的茶籽餅（T7最適合的底物）和質量分數為9%的豆粕（M1，DB2最適合的底物）中搖瓶振蕩培養48 h，以發酵后的生物量，酶活力為依據比較降解效果。

2 結果與分析

2.1 產蛋白酶的茶籽餅降解菌的篩選

2.1.1 初 篩 將若干個樣品經茶籽餅培養基富集培養后，得到數株能以茶籽餅為底物生長且產生胞外分泌蛋白酶菌株，分別編號為T1到TN，其中T1、T6、T7、T9、T20、T31的蛋白水解能力較高。

2.1.2 復 篩 為進一步驗證供試菌的降解能力，將初篩菌種中產生蛋白水解圈較大的6株菌發酵培養后，菌株T7表現出的酶活力和生物量為最優，因此選擇T7為出發菌，如表2所示。

表2 菌株對茶籽餅的降解效果

2.2 單因素優化

2.2.1 茶籽餅的質量分數 菌株T7在不同茶籽餅質量分數下表現出的酶活力及生物量差異如表3所示。菌株T7在茶籽餅質量分數為9%時所表現出的生物量與蛋白酶活力最高，說明茶籽餅中所含的抑菌物質對菌株T7抑制作用很小，在茶籽餅質量分數9%以下，隨茶籽餅質量分數的升高，基質中所含的某個或某些物質可能促進該菌種生長及蛋白酶的合成及分泌，而造成酶活和生物量區間性的線性增加，為此選擇質量分數為9%的茶籽餅作為底物。

表3 不同的基質質量分數對生物量及酶活力的影響

2.2.2 碳 源 在發酵培養基中加入了麥芽糖能明顯提高蛋白酶活力及生物量。結果一方面表明C/N比的升高能提高酶活及生物量，另一方面可能是因為加入麥芽糖為雙糖，在發酵工藝上一般是屬于菌體非直接利用的碳源，即對于該菌體而言，麥芽糖可能既是作為一種適合其自身的慢速利用碳源，對其蛋白酶分泌產生了延長作用，其水解產物葡萄糖又可能作為了一種誘導因子，對其蛋白酶的合成在分子水平上產生了誘導作用，結果如表4所示。

表4 不同碳源對生物量及酶活力的影響

2.2.3 無機鹽離子 由表5可知：Ca2+作為通過增加膜的通透性而促進酶的分泌的作用在本實驗條件下對此菌并沒有顯著作用，可能是由于茶籽餅本身所含有的茶皂素為天然的表面活性劑，對增加膜的通透性的效果更優于Ca2+；加入KH2PO4，NaCl后，發酵液的酶活和生物量都有提高，但酶活升高不顯著，其原因可能由于離子濃度增加促進菌株生長代謝，消耗過量的底物，反而對蛋白酶的合成產生了一定程度的抑制作用；茶籽餅本身含有一定量的無機離子，外加的無機離子對菌體酶活的影響不明顯，如表5所示。

2.3 正交條件優化結果

表5 不同無機離子對生物量及酶活力影響

根據各單因子優化的結果，以質量分數為9%的茶籽餅為底物，麥芽糖作為碳源，結合初始pH值，接種量，培養溫度，做出的正交實驗結果表明最佳培養條件組合是：100 mL培養基中，初始PH值為5，接種量為3 mL，麥芽糖2%，溫度42℃，如表6所示。

表6 正交試驗設計及結果

2.4 最佳培養時間

選擇上述的最佳培養條件，對發酵時間作梯度處理可知，蛋白酶在60 h后合成量顯著增高，但因基質濃度和代謝物累積等因素的影響，生物量明顯降低，代謝途徑傾向于次級代謝產物的合成，菌株T7在84 h時，酶活達到最高，因此選擇84 h為最佳發酵周期。通過凱式定氮法得出，此時粗蛋白降解率為48.7%，其結果如圖1所示。

圖1 不同時間對發酵的影響

2.5 降解菌的評價

將供試菌與M1，DB2于豆粕和茶籽餅中作對比發酵后，菌株T7在以兩種基質作為底物時的生物量差異較小，T7受茶籽餅中受含抑菌物質的影響小，酶活力在茶籽餅為降解底物時活性較高，說明茶籽餅對T7的產酶有促進作用，而菌株M1，DB2明顯受到抑菌成分的影響，對茶籽餅無明顯降解效果。表明菌株T7對茶籽餅的降解作用顯著。三者之間的蛋白酶活力和生物量差異如表7、表8所示。

表7 三種菌株對豆粕的降解效果比較

表8 三種菌株對茶籽餅降解效果比較

3 結果與討論

本研究中，對茶籽餅降解菌進行篩選，得到了一株受茶籽餅中抑菌物質影響小的產蛋白酶菌株，并對其發酵條件優化后，表現出良好的降解效果。

菌株T7，在培養時間優化時，表現出的不同于一般細菌生長曲線的規律，可能是因為該菌株由種子培養基轉接到發酵培養基之后，由于茶籽餅中的大部分營養物質不能直接被細菌吸收利用，而需要經一段時間的降解，導致菌株因基質原因表現出了生長周期的延長或二次生長，進而導致培養周期的延長；另外，在對菌株T7分別對大豆粕和茶籽餅的降解能力比較表明，菌株對茶籽餅表現出了良好的適應性，以茶籽餅為底物的條件下，基質對菌體生長及產酶表現出了明顯的促進性作用，可能在含有大量表面活性劑的基質中，表面活性劑對T7的生長代謝起到了促進作用。

由于茶籽餅中抑菌物質對大部分細菌的生長的抑制作用，導致了利用發酵法降解茶籽餅的困難，但利用菌株T7降解茶籽餅，可提高茶籽餅的綜合利用率和經濟價值，從而減少茶油下腳料的廢棄對環境造成的污染及提高資源的利用率。但此菌株酶活力比一些高活性蛋白酶菌種要低，為此可以進一步嘗試對該菌種進行誘變等方法，提高其酶活性，增加產物得率。此外，菌株T7能隨基質濃度的升高而表現出更高的蛋白酶活力和茶籽餅對其它菌種則出現抑制作用的機理，也值得進一步研究。

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