甘肅高寒陰濕地區蠶豆苗期鐮刀菌根腐病病原鑒定

侯思雯，李敏權，楊曉明，楊發榮

（1.甘肅農業大學，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農業科學院，甘肅 蘭州 730070）

蠶豆（Vicia faba L.）別名胡豆、寒豆、佛豆、羅漢豆等，原產西南亞一帶，是人類栽培的最古老的農作物之一。甘肅臨夏地區高寒陰濕，地處青藏高原與黃土高原過渡地帶，年平均氣溫6.3℃，降水量537 mm，無霜期157 d，適宜春蠶豆種植,是甘肅省乃至全國蠶豆生產的重要基地之一[1]。近年來，土傳鐮刀菌根腐病日益嚴重，成為蠶豆生產的主要限制因素之一。據報道,重病田蠶豆死亡率達60%～90%,甚至絕收[2]。蠶豆鐮刀菌根腐病是一個世界性蠶豆病害，自1890年德國人Kirchmer報道以來，先后在美國、加拿大、意大利、蘇丹、中國等國家見諸報道。我國自俞大紱等1944年報道以來，在云南、浙江、江蘇、青海、甘肅等蠶豆栽培區均有病害發生及病原研究的報道，且多地報道的病原存在差別。本試驗對甘肅臨夏地區蠶豆苗期鐮刀菌根腐病病原菌進行分離鑒定，旨在明確危害該地區蠶豆生產的病原菌種類，為今后蠶豆的抗病育種和病害防治提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 田間調查與樣品采集

在蠶豆播種出苗后，分別于臨夏縣、康樂縣田間調查并采集具有典型根腐病的病株。所采標本用聚乙烯袋保存，當天帶回實驗室分離。

1.2 病原菌的分離

采用常規的組織分離技術。將具有典型癥狀的蠶豆根經流水沖洗12 h，再從病健交界處切取0.5 cm大小的組織塊，使用0.1%升汞溶液進行表面消毒1 min，用無菌水清洗3遍后，在滅菌濾紙上將水吸干，然后在無菌條件下置于PSA培養基平板上，25℃下培養。每天進行觀察，待有肉眼可見的菌落出現時，取菌落前沿菌絲轉皿，繼續在25℃下培養備用[3]。

1.3 病原菌的純化

經過培養的菌株，在顯微鏡下初步鏡檢，對已產孢的，直接進行單孢分離，對未產孢的經制作CLA培養基誘導產孢后進行單孢分離。置于PSA培養基25℃恒溫培養箱中培養，4 d后測定菌落生長速率，觀察并記錄菌落培養性狀、色澤等形態學性狀[4-5]。

1.4 病原菌的鑒定

根據Booth.C和Lester B.分類系統[4-6]，將分離獲得的菌株進行種的鑒定。

1.5 致病性的測定

蠶豆品種為臨蠶七號，由臨夏農科所提供。采用盆栽法和平皿法進行分離物的致病性測定。盆栽法：采用室內盆栽土壤接菌的方法,按滅菌土壤5%的菌量混土育苗，每盆5株。試驗設3次重復，于一個半月后調查發病情況[7]。平皿法：在25℃下，將待測分離物在PSA培養基上恒溫培養7 d后，打制直徑為5 mm的菌餅，轉入WA平板（150 mm）,25℃培養4 d，取蠶豆種子使用0.1%升汞溶液進行表面消毒1 min，滅菌水沖洗3次,均勻排列在帶菌水瓊脂培養基上,每皿10粒。試驗設3次重復，以不接菌的WA培養基上同樣處理10粒種子為對照，7 d后統計種子的發病率以及病情指數[8]。再從接種發病的植株上分離病原物，與鑒定并接種的菌株進行比較確認。

觀察蠶豆胚根上的發病癥狀，病害共分5級：0級，健康無病；1級，幼苗胚根尖部位出現壞死斑點癥狀，但不軟腐；2級，幼苗胚根上出現變軟和腐爛癥狀；3級，壞死幼苗，萌發種子幼苗胚根腐爛；4級，霉爛壞死的種子或不萌發而腐爛的種子。發病率、病情指數的計算分別見式（1）、式（2）。

2 結果與分析

2.1 蠶豆根腐病田間癥狀表現

田間發病癥狀表現為發病植株生長緩慢，植株矮小，葉片發黃，植株下部葉片葉緣變黑，產生大小不等黑色枯斑，嚴重時整葉變黑焦枯，甚至植株死亡。病株地下部分主根和根頸病部位變黑，有縊縮。

2.2 病原菌分離

對66株田間根腐病株進行分離，共獲得34個鐮刀菌（Fusarium spp.）分離物,其分離頻率達51.52%。

2.3 病原菌鑒定

如表1所示，所得病原鐮刀菌分別是茄鐮刀菌（Fusarium solani）、半裸鐮刀菌（Fusarium semitectum）和單隔鐮刀菌（Fusarium dimerum）。病原菌的主要鑒定特征如下。

表1 蠶豆根腐病病原鐮刀菌分離

2.3.1 茄鐮刀菌（F.solani（Mart）Sacc.emend.Snyder&Hansen）在PSA培養基上，其生長速率為3.1 cm，PSA基物背面觀察呈白色、近圓形、絨毛狀，菌絲內有橫膈膜，大型分生孢子數量多，馬特形，頂部細胞鈍圓，基胞足跟不明顯；小型分生孢子數量多,橢圓形或卵形。厚垣孢子在菌絲中間產生，單瓶梗長。

2.3.2 半裸鐮 刀菌 （F.semitectum Berk&Rav）PSA培養基上生長速率為3.45 cm，PSA基物背面觀察初為白色，后至駝黃色，氣生菌絲繁茂。在WA培養基上呈白色而且菌絲稀疏。小型分生孢子少見，大型分生孢子有兩種形態:其一為紡錘型，兩端均為楔形，多為3～5隔。其二為鐮刀型頂端楔形，基胞有明顯足跟，多為5隔。產孢細胞有兩種，分別是多芽生和復瓶梗，厚垣孢子球型，多串生，間或頂生。

2.3.3 單隔鐮刀菌（F.dimerum Penzig in Saccardo） 在PSA培養基上生長速率為3.05 cm,PSA基物背面觀察為杏黃色，氣生菌絲繁茂，致密，絮狀。大型分生孢子短，中等偏窄，兩端稍尖，頂胞彎曲，單個隔膜，形態一致，在培養基與康乃馨葉片上產生橘紅色的分生孢子座，厚垣孢子在菌絲間單個間生或串生，表面光滑。

2.4 致病性測定

2.4.1 盆栽法致病性測定結果 盆栽法試驗結果表明，接種的3種鐮刀菌都能致病，且引起的癥狀相似。具體表現為植株感病后，首先從根尖開始變色，進而主根下半部出現褐色條斑，病斑多不凹陷，以后逐漸擴大，表皮及皮層變黑壞死，葉片由下而上逐漸變黃，植株矮化，但病程進展比較緩慢，嚴重時可造成整株死亡（表2）。

2.4.2 平皿法致病性測定結果 平皿測定結果見表3。接菌的種子在發芽9 d后陸續發病，幼苗初生根尖部開始出現壞死斑點癥狀，隨時間的推移，胚根上出現變軟及腐爛癥狀，直至萌發種子幼苗胚根腐爛，最終死亡。

由表3可知，不同菌種致病性強弱不同，在3種鐮刀菌不同菌株間致病性強弱也有顯著差異。其中，茄鐮刀菌1～18號，半裸鐮刀菌1～4號，單隔鐮刀菌1、2號為強致病性菌株；半裸鐮刀菌5～8號、10號，單隔鐮刀菌3～5號、7號為中等強度致病性菌株；半裸鐮刀菌9號，單隔鐮刀菌6號，為弱致病性菌株。

表2 鐮刀菌不同菌株致病性盆栽測定結果

表3 病原菌鐮刀菌致病性平皿法測定結果

3 討論

蠶豆鐮刀菌根部病害（Fusarium spp.）是一個世界性的病害，關于蠶豆鐮刀菌根腐病的病原，世界上不同蠶豆栽培地區的報道不盡相同。世界上最早報道蠶豆鐮刀菌根腐病的是德國人Kirchmer，該病的病原是禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum，1890）[10]；隨后Pape報道了蠶豆鐮刀菌基腐病，該病的病原是燕麥鐮刀菌 （F.avenaceum，1920）[10]；Miyake報道了蠶豆鐮刀菌枯萎病，該病的病原是禾谷鐮刀菌（F.graminearum，1924）[10]。從此，世界許多植物病理學家相繼報道了對蠶豆鐮刀菌根病病原的研究成果[4-20]。我國俞大紱對云南冬蠶豆鐮刀菌根部病害進行了系統研究，通過癥狀表現，把蠶豆鐮刀菌根病分為3種類型，即蠶豆鐮刀菌枯萎病，病原是燕麥鐮刀菌蠶豆變種和尖孢鐮刀菌蠶豆變種（F.avenaceum var.fabae；F.oxysporium var.fabae）[10-11]；蠶豆鐮刀菌根腐病，病原是茄鐮刀菌和串珠鐮刀菌（F.solani；F.moniliforme）[12-13,15]；蠶豆鐮刀菌基腐病，病原是燕麥鐮刀菌和禾谷鐮刀菌（F.avenaceum；F.graminearum）[13-15]。這些研究成果為我國蠶豆鐮刀菌根病的研究奠定了良好的基礎。其后，阮興業等研究報道了蠶豆苗期鐮刀菌基腐病，病原有尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）、燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）、串珠鐮刀菌（F.moniliforme）、禾谷鐮刀菌（F.graminearum）和木賊鐮刀菌（F.equiseti）；鐮刀菌基腐萎蔫病，病原是燕麥鐮刀菌蠶豆變種（F.avenaceum var.fabae）；鐮刀菌根腐病，病原是茄鐮刀菌（F.solani）和擬枝孢鐮刀菌（F.sporotrichioides）[17-19]。鮑建榮等報道了浙江省蠶豆鐮刀菌病害的病原主要有銳頂鐮刀菌（F.acuminatum）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）、串珠鐮刀菌（F.moniliforme）、三線鐮刀菌（F.tricinctum）、串珠鐮刀菌膠孢變種（F.var.subglutinans）和茄鐮刀菌（F.solani）[16]。任海英等研究報道了江蘇常熟地區蠶豆枯萎病的病原主要是尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）、燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）、木賊鐮刀菌（F.equiseti）和串珠鐮刀菌（F.moniliforme）[7]。王曉鳴等鑒定青海省春蠶豆鐮刀菌根腐病病原為茄鐮刀菌（F.solani）；蠶豆鐮刀菌枯萎病的病原為尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）[18]。李春杰等研究報道甘肅臨夏地區春蠶豆鐮刀菌根腐病的病原為茄鐮刀菌（F.solani）、尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）和燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）[2]。

本文報道的蠶豆鐮刀菌根腐病的病原茄鐮刀菌與之前的報道是一致的[2,12－13,15,17-18]；而病原半裸鐮刀菌和病原單隔鐮刀菌屬首次報道。單隔鐮刀菌對植物的致病性研究報道較少，有待進一步研究。另外，茄鐮刀菌雖然可以引起多種植物根腐病，但存在幾十種致病專化型，本文報道的病原茄鐮刀菌對其他植物的致病性還有待進一步研究。有文獻報道，蠶豆根腐病存在病原鐮刀菌與其他病原真菌復合侵染的情況[8,11,13]，關于這一問題，尚有待深入細致的研究。

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