NMDA受體2A亞單位mRNA和蛋白質在大鼠海馬前腦缺血再灌注損傷中的變化

張旭 滕大才 徐鐵軍 高偉

迄今為止，國內外研究已證實NMDA受體在腦缺血中介導的興奮毒作用的危害，興奮毒性可導致急性細胞死亡(壞死)，也可激起延遲類型的細胞死亡 (凋亡)［1－3］。現發現NMDAR至少存在7個亞單位［4，5］。其中，NR1亞單位是必需亞單位，2A和2B是主要的調節亞單位。因此把在缺血中起正性作用的亞單位作為靶目標，發展針對缺血性腦血管病的理想藥物，而不干擾這些通道的正常生理功能，是目前和未來發展的趨勢［6］。本研究針對缺血后大鼠海馬NR2A mRNA的表達及蛋白變化情況，探討其可能存在的關系，為進一步研究缺血性腦損傷的分子機制及研制和開發針對NR2A亞單位的特異性新藥提供理論基礎和形態學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器及實驗動物 寡核苷酸探針雜交試劑盒(博士德生物工程有限公司);2A免疫組化一抗(Santa Cruze)，DEPC和DAB(Sigma)公司;實驗動物為健康雄性SD大鼠30只，體重250～300 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供。

1.2 動物分組及模型制作 實驗動物隨機分為3組:正常對照組(NC組，n=6)、假手術對照組(SC組，n=12)、缺血再灌組(IR組，n=12)。采用改良的四動脈阻斷法(4 AO)建立短暫性前腦缺血(15 min)再灌注動物模型［7］，再灌時間為24 h和48 h。在確定的時間點進行灌注固定，滿足以下條件的大鼠進入后續實驗:(1)第1次手術后24 h動物清醒;(2)夾閉雙側頸總動脈后大鼠應:①掙扎＜50 s;②翻正反射消失;③呼吸頻率先快速上升，后下降并穩定在正常范圍;④雙側瞳孔由小變大，由紅變白;⑤角膜反射消失。SC組大鼠除不電凝椎動脈和不夾閉頸總動脈外，其他手術過程同IR組。

1.3 灌注固定及切片制備 IR組在復灌后24和48 h與對應的NC組和IR組大鼠用20%水合氯醛(300～350 mg/kg)腹腔注射麻醉，經心-升主動脈插管灌注固定。在立體定位儀上將鼠腦冠狀位分為前、中、后3段，取包含海馬的中段入0.1 mol/L PBS(4℃，過夜)、入70%乙醇(4℃，過夜)。脫水:80%乙醇(1 h)，95%乙醇(1 h×2)，100%乙醇(1 h×2)，透明:二甲苯(0.5 h×2);浸蠟:62℃(1 h×2);石蠟包埋。將包埋的腦塊作連續冠狀切片，片厚8 μm，以45℃展片，70℃烤片3 h。切片分8套，分別進行焦油紫染色、NR2A原位雜交和免疫組化染色，TUNEL染色及陰性對照染色。

1.4 IHC和ISH反應 IHC按ABC試劑盒說明書和本實驗室方法進行［7］。ISH反應按試劑盒說明書和本實驗室方法進行［8］。

1.5 圖像分析 原位雜交和免疫組化的切片用LE2ICA QWin圖像分析儀對CA1區、CA3區錐體細胞和齒狀回顆粒細胞的染色強度進行灰度測量，以相應背景灰度值減去各測量點灰度值后的平均值作為海馬各區的最終灰度值;TUNEL染色的切片在光鏡下計數CA1區的凋亡細胞數，求出凋亡細胞百分率。

2 結果

2.1 IR組24 h，焦油紫染色結果顯示CA1區細胞形態及數量均無明顯變化;CA3區和齒狀回的細胞未見明顯改變。缺血后48 h，CA1區細胞胞體開始縮小，細胞間隙擴大，細胞淡染，并出現了壞死細胞，表現為細胞體積明顯縮小，細胞固縮，并有破裂。CA3區可見少量的細胞胞體縮小，齒狀回細胞形態和數量未見明顯改變。見圖1、2。

圖1 假手術組(焦油紫×40)

圖2 缺血48 h(焦油紫×40)

2.2 在CA1區，NR2A mRNA的表達于IR組24 h升至SC組的141.5%(P＜0.01)。IR組24 h在CA3區和齒狀回，缺血后NR2A mRNA的表達無明顯變化。見表1，圖3、4。

表1 3組大鼠海馬CA1區NR2A原位雜交強度比較

表1 3組大鼠海馬CA1區NR2A原位雜交強度比較

注:與IR組比較，*P＜0.01

25.6±2.5 24.3±3.2 SC 組(n=12) 27.5±1.2* 23.9±2.8 26.4±3.5 IR組(n=12)CA1 CA3 DG NC 組(n=6) 26.3±3.6*組別38.9±2.4 26.5±3.1 27.1±2.6

2.3 在CA1區，NR2Am RNA的表達于IR組48 h降至SC組的59.3%(P＜0.01)。IR組48 h在CA3區和齒狀回缺血后NR2A mRNA的表達無明顯變化。見表2，圖5、6。

圖3 假手術組(原位雜交×40)

圖4 缺血24 h(原位雜交×40)

表2 3組大鼠海馬CA1區NR2A免疫組化強度比較

表2 3組大鼠海馬CA1區NR2A免疫組化強度比較

注:與IR組比較，*P＜0.01

CA1 CA3 DG NC 組(n=6) 39.4±3.4*組別37.3±3.2 38.5±2.3 SC 組(n=12) 35.9±2.1* 36.9±2.8 37.8± 3.1 IR組(n=12)21.3±2.2 35.2±3.1 35.6±2.4

圖5 假手術組(免疫組化×40)

圖6 缺血48 h(免疫組化×40)

2.4 TUNEL染色顯示IR組24 h海馬CA1區出現了凋亡陽性細胞，而CA3和齒狀回卻沒有出現。IR組48 h細胞凋亡為42.1±2.8，復灌24 h 為 35.2±3.0，差異有統計學意義(P＜0.01)，而CA3和齒狀回卻沒有出現。見圖7、8。

圖7 缺血24 h(TUNEL×40)

圖8 缺血48 h(TUNEL×40)

3 討論

本課題組既往實驗表明，在腦缺血復灌后24、48、72 h，在海馬CA1區NR2A mRNA水平升高［8］，而NR2A蛋白水平降低［7］，但在復灌后6 h～7 d的其他時間點，兩者都呈現一致變化，既都是表達降低［7，8］，為證明此3個時間點的不一致是由不同實驗者、不同批動物所導致還是由于腦缺血早期時2A亞單位確實存在不一致變化這一現象，本實驗研究了同一批大鼠在在腦缺血復灌后24和48 h的mRNA和蛋白的變化情況，以期揭示這一現象的原因所在。

目前已有實驗報道在腦缺血中存在mRNA和蛋白不一致變化的現象，這一現象歸因于在腦缺血時，蛋白的合成，而非轉錄，經常減弱，盡管mRNA的表達總的認為反映了蛋白水平的變化。本實驗結果表明在腦缺血早期NR2A mRNA水平和蛋白水平確實存在著不一致變化。而這一現象在形態學方面并沒有相關報道。

研究表明腦部是唯一依靠氧化磷酸化來產生能量代謝的。全腦缺血導致細胞功能所受影響之一就是蛋白質的合成。在嚙齒類，在腦血流只有正常的70% ～80%時，腦蛋白質的合成是下調的。這一數值超過了維持ATP生產的灌注率。這一結果表明并非只有能量因素參與了翻譯的下調過程。在復灌中，蛋白的合成被強烈抑制，它的恢復也比能量代謝的恢復慢的多。有趣的是，在易損性的神經元壞死之前，觀察到持續的翻譯抑制［9］。在易損性神經元中阻止翻譯的恢復這一確切的機制尚不明確，但在翻譯的下調和神經元的易損性之間這一驚人的聯系中，表明前者在導致缺血細胞死亡這一發病機制的級聯反應中起了關鍵性的作用［9，10］。因此本實驗表明NR2A亞單位在海馬CA1區神經元的死亡中起了重要作用。

多項研究已經證明了這一結論即mRNA的水平并不絕對預示著相應的蛋白水平［11］。腦缺血中，翻譯和轉錄并不相伴這一現象不僅是時間依賴性的，而且在全腦缺血中，很可能是細胞特異性的［12］。因此，在確定一個特殊的蛋白是否在腦缺血過程中起了重要作用，證實蛋白的表達和/或蛋白的功能絕對必要的。因而，它為未來研究神經保護這一治療目標提供了一個方向。

被缺血誘導的翻譯抑制在抵抗區在最初的12～24 h即恢復，而在易損區則持續收到抑制［13］。本研究發現相對于CA3區和齒狀回，海馬CA1區在24 h即出現了凋亡細胞，在48 h出現了細胞壞死。這與文獻報導的再灌注的2～3 d到第7天遲發性神經元壞死這一過程即開始了相一致［14］。而在缺血后早期2A亞單位的mRNA和蛋白水平既發生了變化，蛋白降低，下調的此蛋白很可能導致了CA1區神經元的功能喪失。因此，這一變化也許參與導致了CA1區在腦缺血中的易損性這一現象和腦缺血的壞死、凋亡過程，表明它在未來的研究中更具有潛在的價值。結合本課題組其他實驗結果表明，在缺血再灌注24 h前，NMDA受體2A亞單位的mRNA和蛋白水平是呈現一致變化的［7，8］。另有實驗證明，缺血再灌注24 h時，海馬區神經元受到的損傷是可逆的，功能狀態受到抑制，在某些條件下如強刺激可被重新激活。可以推測，這時神經元的生存可通過某些條件挽救。這與缺血早期，某些因素的干預可扭轉凋亡方向，阻止細胞的凋亡是一致的［15］。因此，把2A亞單位作為耙目標，觀察阻斷2A亞單位后缺血性腦損傷的變化，也許能揭示2A亞單位在腦缺血中的作用。

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