肝外膽管癌CD44v6、MMP-2的表達及意義

朱林生 王勇 常桂芝

CD44(Cluster of differentiation，CD)是一種分布極為廣泛的表面跨膜糖蛋白，是一種表面粘附分子，主要參與細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的特異性黏附過程。廣泛存在于白細胞、上皮細胞及內皮細胞上，屬于黏附分子中選擇素家族的一員。人類CD44基因位于11號染色體短臂上，CD44分子具有廣泛的生物學功能，包括介導多種細胞與細胞外基質的相互作用，介導白細胞與活化的內皮細胞結合參與炎癥反應，介導淋巴細胞歸巢，并參與細胞偽足的形成和遷移運動。其中CD44v6因有組織的特異性，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉移和預后中起重要作用，因此近年來備受關注?；|金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMPs)是一組鋅離子依賴性內源性蛋白酶，根據其底物的不同，可分成膠原酶、明膠酶、溶基質素等。其中MMP-2屬于明膠酶A類，分子量為72 kD，主要水解Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原、明膠及TNF-α。細胞外基質(extracellular matrix，ECM)是廣泛存在于細胞之間的網狀結構，主要由膠原構成，其除對細胞起支持與連接作用外，還參與細胞的增殖及分化等多種生理過程。MMPs是一組ECM的重要降解酶，對ECM的穩(wěn)定有重要作用。近年來大量證據表明基質金屬蛋白酶，特別是MMP-2在介導腫瘤細胞的細胞外基質降解中起重要作用。MMP-2活性和表達的增加與人類多種惡性腫瘤的侵襲、轉移及預后密切相關。本研究通過檢測膽管癌組織、膽管良性病變組織中CD44v6及MMP-2的表達情況，揭示CD44v6及MMP-2與膽管癌分期、分化程度、淋巴結轉移之間的關系，為腫瘤臨床診斷、治療及預后提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究所有肝外膽管癌標本均選自我院2008年12月至2010年5月手術切除原發(fā)性膽管癌患者45例，其中男26例，女19例，男女比例為1.39∶1;年齡47～75歲，平均年齡53.7歲;術前未接受任何抗腫瘤治療。術后病理組織學均為腺癌。分化程度:高分化17例，中分化15例，低分化13例。TNM分期:Ⅰ，Ⅱ期共12例，Ⅲ期20例，Ⅳ期13例。有淋巴結轉移28例，無淋巴結轉移17例。正常對照非癌膽管組織10例，因梗阻性黃疸、膽管炎、膽總管囊腫行膽腸吻合術，術后病理證實為非癌膽管組織，膽總管囊腫6例，硬化性胰腺炎2例，胰膽管合流異常1例，十二指腸乳頭炎致膽總管狹窄1例。所有標本均為手術切除新鮮標本。標本取材后由中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。每份標本連續(xù)4 μm厚切片3張，1張行常規(guī)HE染色核實診斷，2張用于免疫組織化學染色。試劑:鼠抗人CD44v6單克隆抗體購自美國Zemd公司，濃縮液0.1 ml。鼠抗人MMP-2單克隆抗體，濃縮液0.1 ml。SP試劑盒、DAB顯色劑均由北京中山生物制品公司提供。

1.2 方法 CD44v6及MMP-2均用鼠抗人單克隆抗體連續(xù)4 μm厚超薄組織切片行免疫組織化學染色，染色過程中每批均設立以PBS代替相應一抗制成的陰性對照片，以除外假陽性結果。

1.3 結果判定 CD44v6及MMMP-2均為細胞漿、細胞膜表達。(1)依據細胞著色強度計分:0分:細胞無顯色;1分:淺黃色;2分:棕黃色;3分:棕褐色。(2)依據陽性細胞數計分:0分:無顯色癌細胞;1分:顯色癌細胞占切片癌細胞總數1/3以下;2分:顯色癌細胞占切片癌細胞總數的1/3～2/3;3分:顯色癌細胞占切片癌細胞總數的2/3以上。400倍顯微鏡下每張切片記數5個視野，每個視野100個細胞。每例腫瘤積分等于以上兩項之和。分為:－:0分;+(低表達):1～4分;++(高表達):＞4分。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用直接概率、χ2檢驗及Spearman等級相關檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD44v6、MMP-2表達與臨床病理特征關系 CD44v6、MMP-2表達與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移相關，陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與膽管癌分化程度無關(P＞0.05)。見表 1。

表1 CD44v6、MMP-2的表達與臨床病程特征關系 例

2.2 CD44v6、MMP-2在膽管癌、非癌膽管組織中的表達CD44v6、MMP-2在膽管癌、非癌膽管組織的表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2，圖1、2。

表2 CD44v6、MMP-2在膽管癌與非膽管癌組織中的表達 例

圖1 膽管癌組織中CD44v6陽性表達(10×40，++)

圖2 膽管癌組織中MMP-2陽性表達(10×20，++)

3 討論

CD44是1989年前后發(fā)現的一種細胞表面的跨膜糖蛋白。多項研究顯示CD44v6的過度表達與腫瘤的侵襲、轉移及不良愈后明顯相關［1－4］。CD44v6參與腫瘤浸潤、轉移的可能機制為:(1)CD44v6與透明質酸(HA)結合，并通過HA發(fā)揮促進腫瘤轉移的作用。HA可介導原發(fā)性腫瘤生長及腫瘤細胞在轉移灶中生長;膜表面表達有CD44v6的腫瘤細胞與HA結合后，HA可幫助其完成免疫逃逸，延長腫瘤細胞在血循環(huán)中的時間;當腫瘤細胞表面的CD44分子與血管周圍的HA結合，則腫瘤細胞可以通過受體介導的吞噬作用將HA在溶酶體中降解，使之更易進入循環(huán)而產生轉移，這與吳迪等［3］的肝癌移植術中腫瘤播散組與無腫瘤播散組血清CD44v6水平差異有顯著性實驗結果得到了相互印證。CD44與HA作用減弱使腫瘤細胞更易于脫離原發(fā)灶，進入淋巴或血液循環(huán)，CD44與HA相互作用的增強，使腫瘤細胞易于附著于異地形成轉移灶。(2)使腫瘤細胞獲得與活化的淋巴細胞相類似的生物學特點。活化的T、B淋巴細胞均表達CD44v6，活化的淋巴細胞與腫瘤細胞具有許多相類似的生物學特點，如黏附、遷移、外滲及浸潤等。這些相似性可能基于完全相同或相似的分子特性。CD44v6可使腫瘤細胞獲得與活化的淋巴細胞相類似的生物學特性，模仿淋巴細胞歸巢過程，參與腫瘤細胞淋巴結轉移。(3)影響細胞內骨架蛋白的構象和分布，改變腫瘤細胞的運動能力。李祖國等［5］觀察了CD44v6對結腸癌細胞骨架的影響，發(fā)現CD44v6單克隆抗體封閉前后結腸癌細胞內肌動蛋白的構象和分布明顯不同，認為CD44v6可能通過細胞內羥基端結構影響細胞內骨架蛋白的構象和分布，從而改變腫瘤細胞的運動能力參與腫瘤轉移機制。(4)研究結果顯示CD44v6分子參與了新生血管的形成，從而惡性腫瘤的微血管密度(MVD)表達上調［6］。(5)參與信號轉導功能，CD44v6可催化Met及其配體復合物的形成，抗CD44v6抗體可阻斷Met的活化［7］。已知受體酪氨酸激酶的胞漿結構域是細胞內信號轉導網絡中各種成分的停泊點。缺乏激酶結構域的受體常需與受體酪氨酸激酶協(xié)同作用，或通過調控激酶的活性而介導細胞的信號轉導。CD44黏附分子則具有這種協(xié)同受體作用CD44參與信號轉導中跨膜復合體的組裝［8］，在細胞增殖與停滯間充當分子開關的角色，當CD44胞漿結構域尾部與磷酸化的ERM蛋白結合時促進細胞增殖，而與脫磷酸化的Merlin蛋白結合時則阻斷Ras→Raf→MEK→ERK的信號轉導使細胞生長停滯。

MMPs是一組鋅離子依賴的內源性蛋白酶，根據其底物的不同可分為膠原酶、明膠酶及溶基質酶素等。MMP-2屬于明膠酶A。MMPs的抑制劑稱為組織基質金屬蛋白酶抑制劑。MMP-2的表達上調及MMP-2/TIMMP-2比例失衡被認為與惡性腫瘤的浸潤轉移有關［9－11］。MMP-2的主要水解底物為Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原、明膠及TNFα。細胞外基質(extracellular matrix，ECM)主要由Ⅳ型膠原及層粘連蛋白(LN)等構成。MMP-2可以降解細胞外基質，在正常穩(wěn)定狀態(tài)組織中MMP表達量極少，而在細胞轉化過程中表達量上升。體外實驗結果顯示MMP-2在介導腫瘤細胞的細胞外基質降解過程中起主要作用，轉染S100A4基因上調MMP-2表達使胰腺癌細胞具有高侵襲性，MMP-2表達下調胰腺癌細胞體外遷移和侵襲能力顯著降低［10，12］。實驗結果表明隨著MMP-2表達增強，進入循環(huán)的腫瘤細胞也增多［13］。MMP-2在腫瘤新生血管形成中也起重要作用。MMP-2可誘導血管新生亦被基因敲除的動物模型所證實［14］。

因此我們可聯(lián)合檢測術后膽管癌組織中CD44v6及MMP-2的表達作為預后指標，同時我們應以CD44v6及MMP-2為切入點對其進行精細調節(jié)，開辟膽管癌治療新領域。

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