河北地區漢族人群RhD陰性血型中Del基因型分布

喬芳 石翠英 何路軍 王振雷 趙志弘 劉敬閃 張虹 田亞娟

到目前為止，Rh血型系統是國際輸血協會(ISBT)已確認的29個紅細胞血型系統中最復雜、最具多態性的血型系統，主要包括 D、E、C、c、e 5 種抗原，D 抗原(ISBT004.001;RH1)的免疫原性最強，是臨床上引起新生兒溶血病、溶血性輸血反應的最重要的血型抗原［1］，其在紅細胞上質和量的改變可產生弱D、部分D和Del型，統稱為D變異型［2］。決定人類RH血型的RHD/CE基因位于染色體1p34.3～36.1，包括D基因和CE基因，分別由10個外顯子組成，編碼區總長均為1251bp，分別編碼417個氨基酸組成的糖蛋白:D抗原和CcEe抗原。任何座位上的基因突變都可能改變抗原的蛋白結構［3］。通常RhD抗原的確認方法為抗人球蛋白(AHG)試驗，但現已證實經抗人球蛋白試驗鑒定的RhD陰性個體中存在RhD弱表現型:RhDel型。Del表型是一種變異的極弱RhD陽性血型，會引起Rh陰性受血者產生抗D抗體，因此，對于包括Del在內的極弱Rh陽性表型的研究成為熱點。本研究采用吸收放散試驗檢測D抗原，鑒定出RhDel，再觀察D基因存在情況。

1 材料與方法

1.1 材料 河北地區隨機抽取2008至2010年期間河北省血液中心漢族RhD陰性獻血者血樣332份，無親緣關系。

1.2 血清學實驗 按照中國輸血技術操作規程確定所有樣本的RhD、C、c、E、e抗原。3批抗-D血清來源:上海血液生物醫藥有限公司、德國BIOTEST公司、美國IMMUCOR公司。使用間接抗人球蛋白試驗排除血樣中的弱D和不完全D表型。剩余樣本通過吸收放散實驗篩選Del表型［4］。

1.3 Rh吸收放散實驗 IAT陰性樣本用乙醚做吸收放散試驗，以確定是否為Del型。

1.4 基因組DNA提取 嚴格按照TIANGEN血液基因組DNA純化試劑盒說明書操作，提取基因組DNA，紫外分光光度計檢測OD260/OD280以確定DNA濃度及純度。置于－20℃保存。

1.5 RhD基因特異性外顯子的PCR檢測

1.5.1 序列特異性引物(sequence specific primers，SSP)設計:根據文獻Maaskant-van等［5］設計的RHD基因PCR引物體系，對 RHD 基因第3、4、5、6、7、9 特異性外顯子進行等位基因特異性PCR擴增，另合成內對照引物HGH(human growth hormone，HGH)，引物由上海生工公司合成。見表1。

表1 RHD特異外顯子及1227A的PCR-SSP引物序列及反應特異性

1.5.2 PCR 檢測:每個 PCR 反應體系的總體積為 10 μl，含有90 ng/μl基因組 DNA，10 pmol/μl dNTPs，25mM MgCl2，內對照引物 5 pmol/μl，RHD 基因特異性外顯子引物 10 pmol/μl，5 U/μl GoTaq Flexi DNA 聚合酶(Promega，Madison，WI，美國)。PCR 反應流程為 95℃ 2 min，95℃ 30 s，54℃ 45 s，72℃ 1 min，35個循環，最后72℃ 10 min。PCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀拍照觀察結果。

1.6 RhD基因序列分析

1.6.1 PCR擴增:擴增/測序引物序列見表2(擴增/測序相同)。RHD基因EXON1-10共10孔，每孔50 μl dNTP-Buffer工作液中加入0.5 μl Taq 酶(5 U/μl)，再加入 5 μl樣本 DNA，1 μl擴增引物(引物終濃度為 0.2 μmol/L)混勻。按以下循環參數進行 PCR擴增:96℃ 2 min，1 cycle;96℃ 20 s/68℃ 60 s 5 cycles;96℃ 20 s/64℃ 50 s/72℃ 1.5 min，10 cycles;96℃20 s/61℃ 50 s/72℃ 1.5 min，25 cycles;72℃ 5 min，1 cycle。每孔再加入15～20 μl石蠟油，蓋好反應管。將引物板放入已經設置好參數的PCR儀內，并啟動PCR程序，直到循環結束。按照一定的順序，將每個PCR反應產物轉移到已經準備好的1%瓊脂糖凝膠系孔中，140～150 V電泳15～20 min。觀察條帶的特異性擴增效果。

1.6.2 測序反應:用膠提取試劑盒純化PCR產物進行測序反應，測序反應體系:BigDye v3.1 混合液 16 μl、PCR 純化產物4 μl。測序反應條件:96℃ 變性 20 s、50℃ 退火 30 s、60℃ 延伸2 min進行25 cycles;4℃保溫。使用ABI基因測序儀進行測序，測序結果使用Chromas2.31軟件閱讀測序圖譜進行分析。

表2 PCR擴增RHD10個外顯子與測序引物序列

2 結果

2.1 血清學分析 332例經IAT確認的Rh陰性樣本中各表型分布為ccee 152例，Ccee 129例，ccEe 20例，CCee 18例，CcEe 11例，ccEE 2例;檢出RhDel型72例(21.7%)。見表3。

表3 RhD吸收放散試驗陰性個體中Rh表型和RhD基因外顯子分析 例

2.2 RhD基因特異性外顯子檢測 332例經IAT確認的Rh陰性樣本中，檢出RHD基因83例(25%):RHD基因外顯子完整79例，其中Ccee 62例、CCee 8例、ccEe 5例、CcEe 4例，部分缺失4例，其中Ccee 2例，CCee 2例。

圖1 PCR-SSP結果圖

2.3 RhDel基因型檢測 79例 RHDel型樣本中，檢出RHD1227A基因73例，非RHD1227A基因型6例。見圖2。

圖2 檢測RHD(K409K)等位基因的PCR-SSP結果

2.4 RhD全部外顯子測序分析 6例非RHD1227A的樣本進行10個RHD外顯子的序列測定，均發現兩條RH基因都在第五外顯子的711缺失一個C，為RHD 711Del，形成移碼突變。見圖 3、4。

圖3 正常RHD基因第5外顯子和該例標本有缺失基因的部分序列圖譜

圖4 正常RHD基因第8內含子和該例標本有突變基因的部分序列圖譜

3 討論

1984年，日本學者Okobo在RhD陰性獻血者中發現一種非常弱的RhD抗原表達型，命名為Del表型。其非常弱的RhD抗原無法用敏感的間接抗人球蛋白試驗檢出，而只能通過吸收放散試驗才可檢測出來。此型主要存在于中國和日本人群［6］，據報道臺灣地區漢族RhD陰性人群中約32.6%為Del型［6］，香港為 20% ～30%［7］，日本僅有 10%［8］。本研究中，332 例RhD陰性獻血者的Rh表型以ccee和Ccee頻率最高，而CCee和ccEe較低，CcEe及ccEE最低;用吸收放散試驗確認的332例RhD陰性樣本中進一步檢測出83例Del型個體(25%)，與其他研究亞洲人Del型比例的報道數據相近。本組72例RhD吸收放散試驗陰性個體中有5例為cc型，提示RhD陰性個體攜帶RHD基因與RhC抗原之間并無恒定關系。

RHD基因與編碼C、c、E、e抗原的RHCE基因具有極高的同源性(約96%)，其間僅有40個核苷酸不同，這40個核苷酸分別位于 RHD 和 RHCE基因第3、4、5、6、7、9外顯子。因此在PCR試驗中，擴增引物的3’末端均是RHD特異性堿基，可準確檢測RHD基因的完整性［9］。RHD基因具有多態性，使Rh血型系統中產生了許多D變異的亞型。Del表型就是其中非常特殊的一種。人們發現Del表型個體存在幾乎完整的RhD基因，在Del型是否歸于RhD陰性這一點上并沒有形成共識。在日常實踐中，帶有Del表型的個體經常遇到且不被認定為Rh陽性。因此，Del型血液會經常輸注給Rh陰性患者但幾乎沒有引起原發的輸血反應。最新的幾項研究報道了RhD陰性患者接受了Del血型個體的血液后產生了免疫抗D抗體。目前在不同人種中已發現多種Del的等位基因［10－16］。83例Del型個體中，有79例Del型均攜帶RhD完整基因，鑒于Del表型在中國漢族人RhD陰性人群中比例較高，因而研究其分子機制、抗原表達和免疫對臨床輸血意義重大。對該79例Del型樣本進一步進行 PCR-SSP檢測，發現有73例 Del型均攜帶 RHD(K409K)等位基因，研究結果和臺灣地區報道的一致，即主要由RHD1227A等位基因引起;另外6例非RHD(K409K)樣本，采用擴增RHD基因第1-10外顯子及測序引物，與正常外顯子序列進行比對，發現6例均為兩條RH基因在外顯子5的711缺失一個C，為RHD 711Del，710-712的CCG變成為CGT，形成移碼突變所致，并同時檢測到在內含子8的4779的位置處存在一個純合突變，即4779C/T，而外顯子9未發現異常，該結果在河北地區屬首次報道。另外該種Del表型的分子背景中，是否第5外顯子的缺失與第8內含子的純合突變同時存在，還需要進一步擴大研究樣本。

目前，世界上至少發現了2例真正的Rh陰性受血者由于輸入Del表型血液，而產生抗D的病例［17］。在血清學試驗中，鑒定Del型的吸收放散試驗較繁瑣，而且受多種因素制約，因此實驗結果可能會難以判斷，本研究中通過比較血清學的吸收放散試驗和RhD基因特異性外顯子檢測試驗結果證明血清學試驗有11例Del漏檢。所以應進一步研究Del型分子機理，建立簡便準確的基因定型方法，作為確認Del型的理想替代方法。本研究結果表明利用堿基多態性設計序列特異性引物，建立簡易的PCR-SSP方法是一種檢測Del表型的可行途徑。

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