甜瓜白粉病內生拮抗細菌的篩選鑒定及其防治效果的研究

馬英元, 欒非時, 馬鴻艷, 王學征

(東北農業大學園藝學院,哈爾濱 150030)

白粉病是甜瓜作物上廣泛發生的一種嚴重的世界性病害[1]。該病從苗期到成株期均可危害,嚴重降低了甜瓜品質和產量,在生產上造成了很大的經濟損失。隨著設施瓜類栽培面積的逐年擴大,白粉病的危害范圍也更加廣泛。目前,白粉病已成為我國瓜類蔬菜無公害生產的主要障礙之一[2]。多年來,國內外眾多研究者對白粉病的防治展開了一系列研究,提出了各種防治措施。而生物防治以其安全、高效及無污染等特點已經成為植物病害防治的重要途徑[3]。許多研究證明,健康植物體內存在大量的內生細菌,它們是植物病害生物防治的潛在資源菌[4-5],具有潛在的應用和開發價值。國內外已有報道用真菌、土壤拮抗細菌及放線菌等[6-8]來防治白粉病,但利用內生細菌防治甜瓜白粉病的報道還較少。本研究旨在從高抗甜瓜品種的植株內分離篩選出對該病害有較好防效的菌株,以期為甜瓜白粉病生物防治探尋新途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甜瓜白粉病病原菌[Sphaerotheca fuliginea(Sch lecht.ex Fr.)Po ll]為東北農業大學西甜瓜遺傳育種研究室分離保存S.fuliginea 1號生理小種。

細菌培養采用NA培養基,液體培養采用NB培養基。

甜瓜抗病品種‘MR-1’為內生細菌的分離材料;甜瓜感病品種‘甜帥’用于室內盆栽試驗篩選菌株。

1.2 內生細菌的分離、純化及其發酵液的制備

采集健康無病的甜瓜高抗白粉病品種‘MR-1’植株,按照常規無菌操作進行內生細菌的分離。將植株用水沖洗干凈后,取適量的根、莖、葉組織剪碎后,在75%乙醇中浸泡1 min,然后在0.1%升汞溶液中浸泡60～180 s,再放入75%乙醇浸泡30 s,取出后用無菌水沖洗4次。在無菌研缽內加入10 ML無菌水和少量滅過菌的石英砂研磨成勻漿,加蓋靜置30 min,吸取0.1ML于NA平板上,涂抹均勻后置于32℃培養箱中,培養48 h后,根據菌落形態、顏色和大小選取不同菌落在平板上進行純化保存。以組織消毒后用無菌水第4次沖洗液作為空白對照(CK),涂皿,3 d后如有菌落生成,表明消毒不徹底,棄去;若CK中無菌落,則研磨液中長出的菌是內生細菌,進行純化培養后,于4℃冰箱保存備用。

將分離純化到的細菌菌株轉接在NA斜面培養基上,24 h后接在裝有NB液體培養基的三角瓶(100 ML/250 ML)中,在恒溫搖床上培養48 h(170 r/min,28℃),得到的發酵原液用已滅菌的蒸餾水適量稀釋后,采用平板菌落計數法將原液制成菌體含量為108cfu/ML的發酵液。

1.3 溫室盆栽試驗篩選內生拮抗菌

將預先制好的內生細菌發酵液(108cfu/ML)噴灑在‘甜帥’三葉期幼苗葉片上,24 h后,接種甜瓜白粉病病原菌孢子懸浮液(106個/ML),20～24℃下保濕24 h。每處理5株幼苗,4次重復,以噴清水為對照。7～12 d后待對照充分發病,進行病情調查并按公式計算病情指數和防治效果[9]。

1.4 葉盤復篩試驗

對溫室試驗中篩選出的防治效果明顯的菌株進行葉盤漂浮法復篩。用直徑15mm打孔器從健康‘甜帥’幼葉上切下葉盤,在內生細菌發酵液(108cfu/ML)中浸濕后晾干,正面朝上懸浮在加有苯胼咪唑(25mg/L)的無菌水表面。將保存在幼苗上的白粉菌孢子抖落在懸浮葉盤上,蓋上培養皿蓋,置入光照培養箱(22℃,光照16 h/d)。每9個葉盤為1個處理,重復3次,以清水為對照。7～10 d后參照王美英等[8]分級標準調查病斑面積,并計算病情指數和防治效果。

1.5 內生拮抗菌對白粉菌孢子萌發和產孢量的影響

對上述兩種方法篩選到的拮抗菌株,采用葉盤法進行試驗(同 1.4),將培養皿置入光照培養箱(22℃,光照L∥D=16 h∥8 h)中。接種白粉菌后于不同時間取樣,用考馬斯亮藍染色法[10]在光學顯微鏡下觀察,統計不同拮抗菌處理后離體葉盤上白粉菌孢子萌發率。分生孢子形成數量參照D.Romeroa等[11]方法進行統計,即取處理10 d后的葉盤置于0.02%Tween溶液中,然后停靠在漩渦儀上30 s,將葉盤上的分生孢子打散。用血球計數板在光學顯微鏡下計數(分生孢子數/mm2)。

1.6 掃描電鏡觀察菌株Mg15對甜瓜白粉菌的作用

采用葉盤法進行試驗(同1.4),經菌株Mg15發酵液(108cfu/ML)處理過的葉盤,接種白粉菌后于不同時間取樣,按掃描電鏡常規方法[12]制樣后,在JEOL-6360型掃描電鏡下觀察,以清水處理為對照。

1.7 拮抗菌株Mg15溫室防病效果測定

取‘甜帥’4片真葉期幼苗,分別用Mg15原液和稀釋5倍、10倍、20倍液噴霧,每株15ML,24 h后接種白粉病菌。每個處理5株,3次重復,7～12 d后待對照充分發病,進行病情調查并計算防治效果。

1.8 拮抗菌株Mg15的鑒定

1.8.1 生理生化及形態鑒定

參照《伯杰細菌鑒定手冊》〈第 8版〉[13]和《常見細菌系統鑒定手冊》[14]利用形態學和生理生化方法對拮抗菌株Mg15進行鑒定。

1.8.2 分子生物學鑒定

采用CTAB法[15]提取菌株 Mg15基因組DNA,根據原核生物16S rDNA保守序列通用引物進行PCR擴增,引物序列為 R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′;F ：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′。將PCR產物回收后,與 PMD19-T載體連接,轉化大腸桿菌DH 5α感受態細胞,在含氨芐抗性平板上篩選白色菌落,提取質粒DNA驗證陽性克隆,測序,將測定的序列用BLAST軟件在Gen-Bank中與已登錄的16S rDNA進行同源性比較,隨后用DNASTAR5.0軟件進行多序列比對,構建系統發育進化樹。

1.9 數據分析方法

試驗結果采用DPS軟件(7.55)進行統計分析,采用Duncan’s新復極差法進行多重比較,以不同小寫英文字母表示在p=0.05水平上有顯著性差異,大寫英文字母表示p=0.01水平上有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 甜瓜內生細菌的分離及溫室盆栽防病效果

根據菌落形態、顏色、大小的不同,從甜瓜高抗白粉病品種‘MR-1’不同組織中共分離純化到31株內生細菌,其中從根中分離到17株,莖中10株,葉片中 4株,分別編號為 Mg1～Mg17,Mj1～Mj10,My1～My4。對31株內生細菌展開溫室盆栽篩選試驗,結果表明：各菌株的防效在5.38%～74.3%之間不等,其中防效在40%以上的有8株(表1),占總篩選菌株數的25.8%。差異顯著性分析結果表明,菌株 Mg2、Mg9、Mg 14、Mg15 和Mj8防治效果明顯好于其他菌株,其中Mg15防效最好,達到 74.3%。

2.2 內生細菌不同菌株對甜瓜白粉病的葉盤法防治效果

對溫室盆栽初步篩選出的5株內生菌進行葉盤法試驗,結果如表 2所示。5株菌處理后甜瓜葉盤上白粉病病情指數為32.59～53.02,與空白對照之間存在顯著差異,說明這5株內生菌對白粉病均有一定拮抗作用,但各菌株之間拮抗作用有強弱差異,Mg15的防效最好(圖 1),達到 63%,與菌株 Mg2、Mg9、Mg14和Mj8存在顯著差異。

表1 不同內生細菌菌株對甜瓜白粉病的溫室盆栽防病效果1)

表2 不同內生細菌菌株對甜瓜白粉病葉盤法防治效果1)

圖1 葉盤法測定菌株Mg15對甜瓜白粉病防治效果

2.3 內生拮抗菌對白粉菌孢子萌發和產孢量的影響

通過葉盤法試驗,在光學顯微鏡下觀察發現(表3),經5株內生拮抗菌的發酵液處理12 h后,葉盤上白粉菌孢子萌發率顯著低于空白對照,其中菌株Mg15對白粉菌孢子抑制作用最強,孢子萌發率僅為9.29%。另外,5株拮抗菌對葉盤上白粉菌孢子生成量也有一定影響,處理組孢子生成量均低于對照組,其中Mg15處理過的葉盤上孢子生成量僅為189.22個/mm2,與對照相比降低了60%,并且顯著低于其他4株菌株處理效果。

表3 不同內生拮抗菌株處理對離體葉盤上白粉菌孢子萌發和產孢量的影響1)

2.4 掃描電鏡觀察菌株Mg15對甜瓜白粉菌的作用

在掃描電鏡下觀察發現,在拮抗菌株Mg15發酵液作用下,白粉菌孢子不萌發或萌發后菌絲不能正常生長,與對照相比(圖2a、d),菌絲和分生孢子梗皺縮(圖2b、e),有的菌絲中間扭曲膨大,發生畸變(圖2c),說明Mg15發酵液能嚴重影響白粉菌的正常生長發育和擴展。

圖2 掃描電鏡觀察拮抗菌株Mg15發酵液對離體葉片上白粉菌的影響

2.5 拮抗菌株Mg15對溫室甜瓜白粉病的防治效果

菌株Mg15的發酵原液、稀釋5倍、10倍、20倍防治效果如圖3所示,由圖可以看出,不同稀釋倍數的拮抗內生細菌Mg15發酵液對甜瓜白粉病均有一定防治效果。其中Mg15發酵原液防效達到80.66%,隨著發酵液稀釋倍數的增加,防治效果逐漸降低。

2.6 拮抗菌株Mg15的鑒定

2.6.1 生理生化及形態鑒定

拮抗菌株Mg15菌體為桿狀,菌落乳白色、圓形,有的中央隆起,革蘭氏染色陽性,產芽胞,經生理生化特性鑒定(表4),初步確定Mg15菌株為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。

圖3 不同濃度Mg15發酵液對溫室甜瓜白粉病的防治效果

2.6.2 分子生物學鑒定

菌株Mg15經16S rDNA保守序列通用引物PCR擴增后,產物長度約為1.5 kb,經測序,通過用Blast程序對該序列和GenBank中已登錄的 16S rDNA序列進行同源性比較,對比結果發現,與多株枯草芽胞桿菌的16S rDNA核苷酸序列的同源性均在99%以上,把比對結果中相似性較高菌株的序列與供試拮抗菌的序列一起用DNASTAR軟件建立系統發育樹(圖4)。結果顯示,Mg15與枯草芽胞桿菌(登錄號為EU266071.1)的遺傳距離最近。結合生理生化鑒定結果,確定菌株Mg15為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。

表4 Mg15菌株的生理生化鑒定1)

圖4 菌株Mg15及相關菌株的16S rDNA系統發育樹

3 討論

植物內生細菌(endophy tic bacteria)是指能在健康植物組織內棲居而對植物不造成實質性危害并與植物建立了和諧聯合關系的細菌[16]。它是植物體內種類和數量最多的微生物,具有在植株體內分布廣、定殖能力強、防效好以及增殖和擴散快等優點,因而成為發展前景很好的植物病害生防菌[17]。

本研究根據內生細菌的生防優勢,從高抗甜瓜白粉病品種‘MR-1’中分離到內生菌31株,通過溫室盆栽試驗和葉盤法試驗篩選出對甜瓜白粉病拮抗作用最強的菌株為Mg15,盆栽試驗防效達到74.3%。葉盤法篩選比溫室初篩試驗防效稍低,可能因拮抗菌處理方法、病原物接種時間及環境條件等因素引起。Mg15室內篩選結果與溫室防病效果一致,不同稀釋倍數的發酵液對甜瓜白粉病均有一定防治效果,其中Mg15的發酵原液防效高達80.66%。對菌株Mg15生理生化特性和16S rDNA序列鑒定結果表明,該菌株為枯草芽胞桿菌,這與前人研究[18]認為枯草芽胞桿菌對許多植物病原物具有拮抗作用的觀點是一致的。至今已從大豆[19]、桔梗[20]、辣椒[21]等植物體內分離到多株具有生防功能的枯草芽胞桿菌。

Tamehiro[22]等進一步指出枯草芽胞桿菌能產生豐富的具有潛在的植物病害防治價值的抗菌物質,如脂肽類、肽類、磷脂類、多烯類、氨基酸類和核酸類等多種化合物。本研究在掃描電鏡下觀察發現,Mg15發酵液處理后的白粉菌菌絲皺縮生長,甚至產生畸形,說明可能是Mg15發酵液中的胞外代謝產物影響了白粉菌正常生長發育,關于菌株Mg15的具體防病機理以及是否具有促生作用與在甜瓜植株內的生存狀況等問題還有待于進一步研究。

[1]Kuzuya M,Yashiro K,ToMita K,et al.Pow dery Mildew(Podosphaera xanthii)resistance in melon is categorized into tw o ty pes based on inhibition of the infection processes[J].Journal of Experimental Botany,2006,57(9)：2093-2100.

[2]王娟,鄧建新,宮國義.甜瓜抗白粉病育種研究進展[J].中國瓜菜,2006(1)：33-36.

[3]王美琴,賀運春,薛麗,等.番茄內生細菌的分離及拮抗菌株的篩選[J].植物保護學報,2007,34(5)：559-560.

[4]楊海蓮,孫曉璐,宋未.植物內生細菌的研究[J].微生物學通報,1998,25(4)：224-227.

[5]Stu rz A V,Christie BR,Now ak J.Bacterialendophytes：potential role in developing sustainable systems of crop production[J].C ritical Review s in Plan t Scien ces,2000,19(1)：1-30.

[6]Romero D,Rivera ME,Cazorla FM,et al.Efficacy ofmycoparasitic fungi on the developMen t of Sphaerotheca fusca in melon leaves[J].Mycol Res,2003,107(1)：64-71.

[7]鹿秀云,李社增,馬平,等.黃瓜白粉病拮抗細菌的篩選與鑒定及其防病機理[J].中國生物防治,2006,22(增刊)：54-58.

[8]王美英,黃麗麗,康振生,等.植物內生放線菌防治西葫蘆白粉病的初步研究[J].園藝學報,2007,34(6)：1471-1476.

[9]中華人民共和國國家標準農藥田間藥效試驗準則(一)殺菌劑防治黃瓜白粉病[M].北京：中國標準出版社,2000.

[10]W olf G,Fric F.A rapid stainingMethod for E rysiphegraMinis f.sp.hordei in and on w hole barley leaves with a protein-specific dye[J].Phytopathology,1981,71(6)：596-598.

[11]Romero D,de VicenteA,Zeriouh H,et al.Evaluation of biological controlagents formanaging cucu rbit pow deryMildew on g reenhouse-g row n melon[J].Plant Pathology,2007,56：976-986.

[12]Pérez-García A,Olalla L,Rivera E,et al.Development of Sphaerotheca fusca on susceptible,resistant,and temperature-sensitive resistant cultivars[J].Mycol Res,105(10)：1216-1222.

[13]Buchanan R E,Gibbons N E.伯杰細菌鑒定手冊[M].第8版.中國科學院微生物研究所翻譯組譯.北京：科學出版社,1978.

[14]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社,2001.

[15]林加涵,魏文鈴,彭宣憲.現代生物學實驗(下冊)[M].北京：高等教育出版社,2001：98-103.

[16]Di Fiore S.Entophytic bacteria and their possible role in the host plant[C]∥Istven F.Azosp ir iluMV Iand related MicroorganisMs：genetics,physiology,ecology.H eidelberg：Sp ringer,1995：72-78.

[17]彭細橋,周國生,鄧正平,等.煙草青枯病內生拮抗菌的篩選、鑒定及其防效測定[J].植物病理學報,2007,37(6)：670-674.

[18]Dubnau D A.TheMolecular biology of the Bacilli.Volume1：Bacillus subtilis[M].New York：AcadeMic Press,1982：154-156.

[19]BaiY,Aoust F D,SMith D L,et al.Isolation of plant-grow thp roMoting Bacillus strains fromsoy-bean root nodules[J].Can JMicrobial,2002,48(3)：230-238.

[20]Choi EH,Lee S E,Kw on K S,et al.Isolation of nitrogen-fixing bacteria fromgraMineous crop s andMeasu rement of nitrogenaseactivity[J].Ko rean J of Microbial&Biotech,2003,31(1)：18-24.

[21]何紅,邱思鑫,蔡學清,等.辣椒內生細菌 BS-1和BS-2在植物體內的定殖及鑒定[J].微生物學報,2004,44(1)：13-18.

[22]Tamehiro N,OkaMoto Y,OkaMoto S,et al.Bacily socin,a novel phospholipid antibiotic produced by Bacillussubtilis 168[J].AntiMicrob Agen ts Chemother,2002,46：315-320.