有機(jī)酸類化合物對南方根結(jié)線蟲的生物活性

劉丹丹, 段玉璽, 陳立杰, 曲澤蘭, 羅 璇, 劉大偉

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院線蟲學(xué)研究室,沈陽 110161)

根結(jié)線蟲在世界廣泛分布,寄主范圍很廣,溫帶、亞熱帶作物受害尤其嚴(yán)重,病害發(fā)生后一般減產(chǎn)10%～20%,嚴(yán)重的高達(dá)75%以上[1]。在我國北方菜區(qū),南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)可危害30多種常見蔬菜,且又以種植面積較大的番茄、黃瓜、茄子、芹菜等受害最重,已成為蔬菜生產(chǎn)中的嚴(yán)重問題之一[2]。由于采用輪作、抗線蟲品種、化學(xué)農(nóng)藥等防治方法存在局限性,根結(jié)線蟲的生物防治受到廣泛重視[3]。

許多化合物,如酚類物質(zhì)、有機(jī)酸和水溶性揮發(fā)物在降解過程中可以釋放對線蟲有毒殺作用的物質(zhì)[4]。1992年,Kwork等證實(shí)Thorn在1984年發(fā)現(xiàn)的對線蟲有毒性的高等擔(dān)子菌Pleurotus spp.毒素為癸烯二酸[5]。1993年,Stadler等證明真菌代謝物亞油酸對秀麗小桿線蟲(Caenorhabditiselegans)有活性[6]。1994年,Stadler等又報(bào)道亞油酸(linoleic acid)、十八碳二烯酸(S-coriolic acid)、癸烯二酸(2-decenedioic acid)、1-羥基-反式-8-癸烯酸(1-hyd roxy-trans-8-decenoic acid)和檸檬酸(cibaric acid)5種脂肪酸具有殺線蟲活性[7]。2001年,Zuckerman等從黑曲霉(Aspergillus niger)菌株培養(yǎng)液中分離出檸檬酸和草酸,證明對線蟲有毒殺活性[8]。也有報(bào)道赤霉酸與涕滅威同時(shí)施用時(shí),能更有效地抑制柑橘根部和土壤中線蟲的種群數(shù)量,且施用兩個(gè)月后有增產(chǎn)效果[9]。12種不同結(jié)構(gòu)化合物包括醇類物質(zhì)(5-甲基-2-異丙基苯酚,香葉醇,內(nèi)-2-莰烷醇,2-甲基-5-異丙基苯酚,2-辛醇)、醛類物質(zhì)(甲醛,檸檬醛,肉桂醛,對甲氧基苯甲醛,水楊醛)、非芳香酸類物質(zhì)(辛酸)、非芳香硫醇(二烯丙基二硫化物),對最短尾短體線蟲(Pratylenchus brachyurus)和爪哇根結(jié)線蟲(Meloidogyne javanica)有明顯的抑制作用[10]。2003年,由子囊菌(Coronophora gregaria)中分離得到脂肪族類化合物MK7924對秀麗小桿線蟲有抑制作用[11]。2005年報(bào)道從水生真菌 Paraniesslia sp.中得到神經(jīng)鞘脂類物質(zhì)可毒殺松材線蟲(Bursaphelenchus xy lophilus)[12]。已報(bào)道對線蟲有活性的有機(jī)酸種類很多,結(jié)構(gòu)各不相同,明確各有機(jī)酸化合物對南方根結(jié)線蟲的防治效果,對于生產(chǎn)實(shí)踐中進(jìn)一步尋找高效防治線蟲藥劑具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 供試藥劑

選擇有機(jī)酸類化合物作為供試藥劑,具體見表1。

表1 供試有機(jī)酸種類及其在2齡幼蟲致死率和線蟲卵孵化抑制率試驗(yàn)中的濃度

將1.8%阿維菌素乳油(浙江海正化工股份有限公司)作為對照藥劑。

1.2 供試線蟲

供試線蟲為南方根結(jié)線蟲。培養(yǎng)方法為：在直徑6 cm的塑料盆中放入2/3體積的黏土與沙土(黏土∥沙土=3∥1),攪拌均勻后160℃干熱滅菌120 min,栽入2 ～4片真葉期的番茄苗(‘L402’),用南方根結(jié)線蟲單卵囊接種,日光溫室中培養(yǎng)。6周后挖出番茄苗,清水洗凈番茄根部泥沙,用鑷子摘取成熟的黃褐色卵囊,卵囊用0.5%NaOCl表面消毒3Min,無菌水沖洗3次。消毒后的卵囊放于盛有無菌水的培養(yǎng)皿中,此后不斷有線蟲孵化,收集24 h內(nèi)孵化的2齡幼蟲用于試驗(yàn)。

1.3 有機(jī)酸對2齡幼蟲生物活性測定

體積為1 500μL的玻璃小皿經(jīng)過121℃濕熱滅菌30min,每皿中放入30條2齡幼蟲和1 000μL不同濃度有機(jī)酸溶液,每種有機(jī)酸和對照藥劑阿維菌素均設(shè)置 5個(gè)濃度,具體濃度設(shè)計(jì)見表1。在25℃培養(yǎng)箱中放置24 h,觀察線蟲死亡率。觀察時(shí)采用NaOH刺激法判斷線蟲死活[13],在懷疑死亡的線蟲小皿中加入一滴1mol/L NaOH,3 min內(nèi)如果線蟲身體保持不動,按照死亡線蟲計(jì)算。試驗(yàn)設(shè)5次重復(fù),無菌水為對照。

根據(jù)不同濃度有機(jī)酸溶液中2齡幼蟲的平均死亡率,利用DPS統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)算15種有機(jī)酸對南方根結(jié)線蟲的LC50。

1.4 有機(jī)酸對線蟲卵孵化抑制率的測定

挑取大小均一的黃色新鮮卵囊,使用0.5%NaOCl表面消毒后放入玻璃小皿中,小皿中盛有1 ML不同種類的有機(jī)酸溶液,各供試有機(jī)酸以及對照藥劑阿維菌素的試驗(yàn)濃度見表1。每個(gè)處理3個(gè)卵囊,5次重復(fù),室溫下放置。每日調(diào)查2齡幼蟲的孵化數(shù)量,統(tǒng)計(jì)3日內(nèi)的總孵化量,并計(jì)算相對抑制率,利用DPS統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算 LC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)酸對2齡幼蟲的致死率

15種有機(jī)酸對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲致死率測定結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明,各有機(jī)酸對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲均有不同程度的抑制作用,其中甲酸對2齡幼蟲的毒殺作用最強(qiáng),LC50為2.953 7μg/ML。另外乙酸、丙酸和丁酸的作用也較強(qiáng)。對照藥劑阿維菌素的LC50為1.488 8μg/ML,供試各有機(jī)酸的生物活性均低于對照藥劑阿維菌素。

表2 15種有機(jī)酸對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲致死率測定結(jié)果

2.2 有機(jī)酸對線蟲卵孵化抑制率測定結(jié)果

15種有機(jī)酸對南方根結(jié)線蟲卵的孵化抑制率測定結(jié)果表明：甲酸對卵孵化的抑制作用最強(qiáng),LC50為2.146 5μg/ML。其次為丙酸、乙酸和丁酸。試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明,化合物對2齡幼蟲及卵孵化的抑制作用的變化趨勢基本一致。對照藥劑阿維菌素的LC50為0.712 6μg/ML,供試有機(jī)酸的生物活性均低于對照藥劑阿維菌素。具體試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 15種有機(jī)酸對南方根結(jié)線蟲卵孵化抑制率測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

由本研究結(jié)果可以看出,15種有機(jī)酸對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲致死率及卵孵化抑制率存在很大差異,其中甲酸的生物活性最高,丁二酸、蘋果酸等的生物活性最低,兩者之間的生物活性差異達(dá)到了上千倍。其中具有較高生物活性的有機(jī)酸均為分子量較小、化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單的化合物,而高分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物生物活性普遍偏低。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因,推測與有機(jī)酸化學(xué)結(jié)構(gòu)中相關(guān)的官能團(tuán)有關(guān),但是化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性之間的相互關(guān)系十分復(fù)雜,如果能夠明確有機(jī)酸類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性之間的相互關(guān)系,對科研工作者在生產(chǎn)實(shí)踐中尋找高效的藥劑具有指導(dǎo)意義,由于相關(guān)的研究報(bào)道較少,有待于進(jìn)一步的深入探討與研究。

本試驗(yàn)僅利用室內(nèi)離體測定的方法測定了有機(jī)酸對南方根結(jié)線蟲的防效,沒有進(jìn)行田間驗(yàn)證試驗(yàn),因此有機(jī)酸類化合物在生產(chǎn)實(shí)際中的應(yīng)用還需深入研究。

[1]Sasser J N.The international Meloidogyne project-its goals and accomplishments[J].Annual Review Phytopathology,1983,21：271-288.

[2]劉鳴韜.北方蔬菜根結(jié)線蟲病加重的原因及控制對策[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2001(1)：23-24.

[3]祝明亮.根結(jié)線蟲生物防治研究進(jìn)展[C].中國煙草學(xué)會2004年學(xué)術(shù)年會論文集,2004：43-59.

[4]Li Guohong,Zhang Keqin,Xu Jianping,et al.Nematicidal substances fromfungi[J].Recent Patents on Biotechnology,2007,1(2)：1-21.

[5]Kw ork O C H,Plattner R,W eisleder D,et al.A nematicidal toxin fromP leurotus ostrea tus NRRL 3526[J].Jou rnal of CheMical Ecology,1992,18：127-136.

[6]Stadler M,Anke H,Sterner O.Linoleic acid—the nematicidal principle of several nematophagous fungi and its production in trap-forMing submerged cu ltures[J].A rch Microbiol,1993,160：401-405.

[7]Stadler M,Mayer A,Anke H,et al.Fatty acids and other compounds with nematicidal activity fromcu ltures of basidiomy cetes[J].Plan ta Med,1994,60：128-132.

[8]Zuckerman BM,Matheny M,Acosta N.Controlof plant-parasitic neMatodes by a nematicidal strain of Asperg illus niger[J].Jou rnal of CheMical Ecology,1994,20：33-43.

[9]Osman G Y,SaleMFM.Response of Ty lenchulussemipenetrans to plant hormone,giberellic acid and nematicide,aldicarb singly and in combination[J].Anzeiger für Sch?dlingskunde,1994,67：94-96.

[10]Cin ta Calvet,Jorge Pinochet,AmèliaCaMprubí,et al.Evaluation of natural cheMical coMpounds against root-lesion and root-knot neMatodesand side-effectson the infectivity of arbuscu larmycorrhizal fungi[J].European Journalof Plant Pathology,2001,107：601-605.

[11]KuMazaw a S,Kanda M,U tagaw a M,et al.MK 7924,a novel metabolite with nematocidal activity fromCoronophora g regaria[J].The Jou rnal of An tibiotics,2003,56：652-654.

[12]Dong J Y,Li R,He H P,et al.NeMaticidal sphingolipids fromthe freshw ater fungus Paraniesslia sp.[J].European Jou rnal of Lipid Science and Technology,2005,107：779-85.

[13]O liveira D F,Carvalho H W P,Nunes A S,et al.The activity of aMino acids produced by Paenibacillusmacerans and fromcommercial sources against the root-knot nematode Meloidogyneexigua[J].European Journal of Plant Pathology,2009,124：57-63.