四川盆地部分地區土壤中蘇云金芽胞桿菌分離與cry基因鑒定*

周長梅, 戴長春, 王曉云, 李 穎, 趙奎軍

(東北農業大學農學院,哈爾濱 150030)

四川盆地部分地區土壤中蘇云金芽胞桿菌分離與cry基因鑒定*

周長梅, 戴長春, 王曉云, 李 穎, 趙奎軍**

(東北農業大學農學院,哈爾濱 150030)

[目的]對四川盆地土壤中Bt資源進行研究,了解其分布特點,為我國蘇云金芽胞桿菌的儲備奠定基礎。[方法]從四川盆地5個地區采集土樣,分離蘇云金芽胞桿菌野生菌株。利用PCR-RFLP及SDS-PAGE方法對Bt分離株進行基因型鑒定和蛋白分析,并對其室內殺蟲活性進行初步測定。[結果]從207份土樣中獲得26株蘇云金芽胞桿菌野生菌株,出菌率為12.56%。油鏡觀察可看到球形、方形、菱形及不規則形的伴胞晶體。在21株Bt分離株中檢測到cry1、cry1I、cry2、cry9四類基因,且多數菌株都是同時含有多個基因類型,有 5株Bt分離株未發現已知基因;SDS-PAGE顯示有9株菌株只表達了130 ku的蛋白,2株只表達了124 ku的蛋白,2株只表達了45 ku的蛋白,6株同時表達了130 ku和60 ku的蛋白,4株同時表達了124 ku和60 ku的蛋白,2株同時表達了135 ku和60 ku的蛋白,1株同時表達了130、90 ku及75 ku的蛋白。毒力測定結果表明:9株菌株對小菜蛾具有高毒力,2株對大猿葉蟲有一定的殺蟲活性。[結論]四川盆地土壤中Bt資源多樣性豐富,其中有2株有一定的研究前景。

蘇云金芽胞桿菌;cry基因; PCR-RFLP; 毒力測定

*致 謝: 在整個取樣過程中得到代勇、周勤、張錦義、羅宏、李良忠等同學的大力支持和協助,在此深表感謝!

**通信作者 T el:0451-55191854;E-mail:kjzhao@163.com

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是自然界中分布十分廣泛的革蘭氏陽性細菌。該菌的顯著特征是形成芽胞的同時會產生由cry或cyt基因編碼的殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal protein,ICPs),其對靶標昆蟲具有強的毒殺活性,而對人及高等動物無害,因此,Bt成為目前世界上應用最為廣泛的一種殺蟲微生物,也是轉基因抗蟲育種中重要的基因資源。但隨著Bt制劑及轉cry基因作物在田間的大量應用,靶標昆蟲的抗性風險也隨之增強[1-2]。因此充分發掘我國豐富的Bt資源,篩選高毒力菌株和基因,對蘇云金芽胞桿菌進一步的深入研究及開發利用具有十分重要的意義。

蘇云金芽胞桿菌的分布極其廣泛,在土壤、蟲尸、貯藏物、植被以及污水、塵埃等基質上均有廣泛的分布,而在土壤中分布最為豐富[3-4]。四川盆地有其獨特的地貌及生態特點,地形復雜,植被多樣且覆蓋率高,使得微生態系統不易被破壞。因此對四川盆地土壤中Bt資源的研究既有利于了解該地區Bt資源的分布特點,同時也可為我國蘇云金芽胞桿菌的儲備奠定基礎。作者從四川盆地5個地區采集207份土壤樣品,從中分離出26株Bt野生菌株,并進行了基因型鑒定、蛋白分析及殺蟲活性檢測。

1 材料與方法

1.1 培養基

LB培養基:胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、NaCl 1%。pH調至 7.0～7.2,固體培養基加入1.8%的瓊脂粉。121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1/2 LB培養基:除瓊脂粉及pH不變,其他成分減半。

1.2 土樣的采集方法

土樣采自雅安、重慶、內江、樂山、成都5個地區。先將表土層鏟去1～2 cm,再取5～10 cm土層的土壤約50 g,采用五點取樣法,每個采樣點至少取5處,將采集的土樣裝入無菌牛皮紙袋內備用,并標明采集地點、植被、日期等。

1.3 菌株分離及篩選方法

采用醋酸鈉選擇性篩選法進行菌株分離[5]:稱取1.0 g土樣,放入盛有50 mL(含3.4%醋酸鈉)的液體LB培養基中,30℃條件下,200 r/min振蕩培養4 h;取土壤懸浮液10 mL,3 000 r/min離心15 min;取上清液1.5 mL于Eppendorf管中,75℃水浴15 min,取0.1 mL涂于LB培養基上,30℃倒置培養3 d。伴胞晶體的觀察方法參見伯杰氏鑒定手冊。

1.4 cry基因的PCR-RFLP初步分析

參照Kuo及宋福平等根據基因保守區設計的通 用引 物:K5un2/K3un2、K5un3/K3un3、S5uni/S3uni等共10對,鑒定Bt菌株的cry1/7/9、cry1I、cry2、cry3、cry4/10、cry5、cry6、cry8和cry11類基因[6-7]。PCR反應參數:94℃1 min,52℃1 min,72℃2 min,共30個循環。PCR擴增產物的RFLP分析參照文獻[6-7]。

1.5 Bt分離株殺蟲晶體蛋白的SDS-PAGE分析

將活化過夜的Bt菌畫線于1/2 LB培養基上,30℃倒置培養48 h,刮取2 mg左右菌體于1 mL ddH2O中,12 000 r/min離心1 min,棄上清;加入NaCl(1 mol/L)400 μ L 懸 浮,12 000 r/min 離 心2 min,棄上清;加入 100 mL ddH2O懸浮,加入NaOH(0.5 mol/L)25 μ L 于室溫放置 5 min,加入1/3體系的 3×Sample Buffer(T ris3.63 g,溴酚藍0.3 g,SDS 6 g,甘油 30 mL,β-巰基乙醇 15 mL,調pH6.8定容至100 mL)65 μ L,100 ℃煮沸 10 min,12 000 r/min離心10 min,取上清-20℃保存備用。SDS-PAGE分析方法參見文獻[8],以相對遷移率與已知蛋白分子量的半對數值繪制標準曲線測定蛋白的分子量。

1.6 胞晶混合物的制備

將蘇云金芽胞桿菌在LB平板培養基上培養至胞晶分離,用含0.01%T riton-100的 1 mol/L的NaCl收集菌體,用無菌水洗滌3次后再重懸,將該胞晶混合物置于4℃冰箱備用。

1.7 室內殺蟲活性檢測

小菜蛾(Plutella xy lostellaL.)初孵幼蟲,采自園藝實驗站;大猿葉蟲幼蟲(Colaphellus bowringiiL.)由東北農業大學害蟲生物防治實驗室提供。將胞晶混合物用無菌水稀釋成不同濃度。采用浸葉法進行飼喂,將甘藍和小白菜葉片用清水洗凈晾干,在稀釋好的待測樣品中浸泡10 min,晾干,放入生測瓶中,每瓶放入2～3齡幼蟲20頭,每個處理3次重復,飼喂2 d(大猿葉蟲)和4 d(小菜蛾)后調查死、活蟲數。計算其校正死亡率。以無菌水作空白對照,設3個重復。

2 結果與分析

2.1 Bt菌的分離及伴胞晶體形態的多樣性

從四川盆地雅安、重慶、內江、樂山、成都5個地區采集的207份土樣中,共分離出26株Bt野生菌株,出菌率為12.56%(表1)。從表1可以看出:Bt分布的豐度與生態環境有很大關系。采自雅安地區的山林土出菌率最高,為23.07%,其次為采自樂山的山林土及雅安的茶園土,出菌率分別為12.50%及11.76%;而農田土的出菌率均低于山林土,這可能由于山區植被茂密、表土腐殖質含量高,微生態系統不被破壞,導致山林土出菌率較高。

表1 Bt菌的分離結果

顯微鏡檢測發現26株Bt分離株伴胞晶體的形態有球形、方形、菱形及不規則形,且多數菌株都同時含有多種形態的伴胞晶體,充分體現了四川盆地Bt菌株資源的多樣性(圖1)。其中只含有菱形晶體的菌株5株,同時含有菱形、方形、球形晶體的菌株13株,既含有方形又含有球形及不規則形晶體的菌株8株。

圖1 在光學顯微鏡下(100×油鏡)觀察到的Bt菌株

2.2 Bt分離株的SDS-PAGE分析

對26株蘇云金芽胞桿菌SDS-PAGE分析結果表明(表2、圖2)。有9株菌株只表達了130 ku的蛋白,有2株只表達了124 ku的蛋白,有2株只表達了45 ku的蛋白,有6株同時表達了130 ku和60 ku的蛋白,有4株同時表達了124 ku和60 ku的蛋白,有2株同時表達了135 ku和60 ku的蛋白,有1株同時表達了130、90 ku及75 ku的蛋白。

圖2 部分Bt分離株的SDS-PAGE分析

表2 Bt分離株的基因型、晶體蛋白及毒力檢測結果

在目前已知的蘇云金芽胞桿菌各種基因類型中,cry1和cry9類基因表達的蛋白分子量約為130 ku;而cry2類基因表達的蛋白在60 ku左右;cry1I類表達81 ku的蛋白,但SDS-PAGE分析的26株菌株中并未檢測到81 ku的條帶,有文獻報道cry1I類基因通常是沉默的[9],本文的研究結果也印證了這一觀點。

2.3 Bt分離株的cry基因鑒定

通過PCR-RFLP鑒定體系對分離到的26株Bt菌株進行了cry基因的鑒定。結果表明(表2、圖3):有21株菌株含有cry1型基因,8株含有cry1I型基因,11株含有cry2型基因,13株含有cry9型基因;在已鑒定出基因型的21株菌株中,只有5株只含cry1類基因,其余16株菌株均是含有多種類型基因的組合,由表2可以看出cry1Aa、cry1Ac、cry1Ib、cry2Ba、cry9Ba基因型最豐富,同時含有cry1、cry1I、cry2、cry9類基因型的菌株最多為 6株,占已鑒定出基因型菌株的28.57%。另外5株菌株未鑒定出已知基因,有待于重新設計引物進行進一步的分析鑒定。

圖3 部分Bt分離株的PCR-RFLP

2.4 Bt分離株的殺蟲活性檢測

對26株Bt菌株進行了小菜蛾及大猿葉蟲的室內殺蟲活性檢測。結果表明(表2):有9株菌株對小菜蛾具有高毒力,4 d的校正死亡率達100%,卻沒有發現對大猿葉蟲具有高毒力的菌株,只有菌株BF-5及CHD4對大猿葉蟲表現出一定的活性,2 d的校正死亡率分別為42.9%及41.7%。

3 結論與討論

從四川盆地5個地區的山林土及農田土采集的207份土樣中,共分離出26株Bt野生菌株,平均出菌率為12.56%。伴胞晶體的形態有球形、方形、菱形及不規則形,且多數菌株都同時含有多種形態的伴胞晶體,充分體現了四川盆地Bt菌株資源多樣性的特點。通常蘇云金芽胞桿菌的資源分布受土壤類型、pH、土壤腐殖質含量、植被類型等生態環境影響[10-11]。本研究中采樣點雅安地區的山林和峽谷植被保存完好,覆蓋率高,表土中腐殖質含量高,采自該地區山林土的Bt出菌率最高為23.07%,且207份土樣中,山林土的Bt出菌率均高于農田土的出菌率,也充分說明了Bt菌株的分布規律。

通過鑒定發現26株Bt菌中共含有cry1、cry1I、cry2、cry94種基因類型,且多數菌株同時含有多個基因類型。除普遍存在的cry1類基因外,cry9、cry2類基因也有較高頻率,顯示出四川盆地Bt菌株基因型較豐富的特點。

不同類型的cry基因編碼的蛋白表現出不同的殺蟲特異性。通常cry1、cry2、cry9基因編碼的晶體蛋白對鱗翅目害蟲具有毒殺活性[12],本研究中對小菜蛾具有高毒力的9株菌株均含有這幾類基因的基因組合,由此可見含有多種基因類型的菌株通常具有較高的殺蟲活性。自Tailor于1992年克隆的第1個cry1Ia1基因對鱗翅目和鞘翅目的害蟲具有雙重殺蟲活性[13],此后又發現cry1Ia7對葉甲科馬鈴薯甲蟲具有很高的殺蟲活性[14]。本研究中得到的菌株BF-5及CHD4除對小菜蛾具有高活性外,對大猿葉蟲也表現出較好的殺蟲活性,校正死亡率分別為42.9%及41.7%,在這兩個菌株中均未鑒定出cry3、cry8及cry1Ia等對鞘翅目具有殺蟲活性的基因型,但SDS-PAGE分析表明這兩個菌株分別表達了124 ku及135 ku較特殊的蛋白條帶,說明在這兩個菌株中可能含有新的基因或新的殺蟲活性物質。這些研究結果將為今后蘇云金芽胞桿菌的進一步開發利用奠定基礎。

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Isolation and cry gene identification of Bacillus thuringiensis from the soils in some regions of Sichuan Basin

Zhou Changmei, Dai Changchun, Wang Xiaoyun, Li Ying, Zhao Kuijun
(College of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin150030,China)

[Objective]The resources ofBacillus thuringiensisin Sichuan Basin were studied to understand their distribution characteristics and prepared for their use in the future.[Method]Soil samples were collected from five regions of Sichuan Basin toscreen the Bt strains.The genotypes and insecticidal crystal protein(ICPs)of the strains isolated were identified by PCR-RFLP and SDS-PAGE,respectively.The toxicity of the Bt strains toPlutella xylostellaandColaphellus bowringiiwere evaluated in the lab.[Result]Twenty-six wild strains ofBacillus thuringiensiswere isolated from 207 soil samples,which accounted for 12.56%of the soil samples tested.Various shapes of parasporal crystals,includingspherical,square,bipyramidal and irregular,were observed in the strains.The genescry1,cry1I,cry2andcry9were found in 21 strains,and most of them contained more than one gene.However,no known genes were detected in the other five strains.Nine strains expressed the protein of 130 ku,and two strains expressed the protein of 124 ku,and two strains expressed the protein of 45 ku.But six strains expressed both 130 ku and 60 ku proteins,four strains expressed both 124 ku and 60 ku proteins,two strains expressed both 135 ku and 60 ku proteins,and one strain simultaneously expressed 130 ku,90 ku and 75 ku proteins.The bioassay results of the 26 strains indicated that nine of them were highly toxic toPlutellaxylostellaand two of the nine strains showed some toxicity toColaphellus bowringiilarvae.[Conclusion]There are rich Bt resources in Sichuan Basin,and 2 Bt stains isolated from there showed high prospective value.

book=21,ebook=394

Bacillus thuringiensis;crygene; PCR-RFLP; toxicity assay

S 482.39

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.02.004

2010-03-11

2010-05-25

國家公益性行業科研專項(200803032)