云南、貴州玉米大斑病菌生理小種分化研究

何澤民, 李晚忱, 王曉鳴

(1.中國農業科學院作物科學研究所/農作物基因資源與基因改良國家重大科學工程,北京 100081;2.四川農業大學玉米研究所,雅安 625014)

玉米是云南省和貴州省的第一大糧食作物,種植面積分別達132.6萬hm2和73.5萬hm2,是云貴山區農民的重要糧食和畜牧業飼料[1]。云貴地區屬于西藏臺地的延伸部分,平均海拔高,屬溫帶、亞熱帶、熱帶濕潤半濕潤氣候,具有熱量豐富、降雨豐沛、光照條件差、立體氣候明顯等特點[2]。云貴地區的農業耕地主要分布在丘陵山地,而玉米又主要種植在土壤比較瘠薄的山上,生長期處于多雨、多霧、寡照、溫度較低的環境中,這種生產條件為玉米大斑病在兩省的發生奠定了基礎。2008年,國家玉米產業技術體系專家對西南地區的玉米病蟲害調查報告指出,大斑病是云貴玉米生產的主要限制因素之一,大斑病在兩省普遍發生并有逐年加重的趨勢,在云南西北和西南、貴州北部地區持續嚴重發生,給當地的玉米生產造成了嚴重的經濟損失[3]。高原地域的特殊性使玉米大斑病在云貴地區發生具有如下特點：發生危害早,流行蔓延快;隨海拔高度增加而玉米發病呈加重趨勢;在低海拔地區,大斑病和小斑病混合發生[4-5]。

玉米大斑病是一種嚴重的玉米葉枯性病害,由大斑剛毛球腔菌(Setosphaeria turcica,無性態為大斑凸臍蠕孢ExserohiluMturcicum)引起,病原菌存在針對不同抗性基因的生理小種。從1922年印度學者Mitra報道玉米大斑病菌生理分化現象以來,已先后在美國夏威夷、伊利諾斯、德克薩斯等地發現了1號、23號、23N 號 、2N 號小種[6-9];我國小種分化研究始于20世紀70年代末,到目前為止,已發現針對抗大斑病基因 H t1、H t2、H t3和H tN 所有組合的16種小種類型[10-14]。云南和貴州是玉米大斑病多發地區,對其流行的病菌小種進行鑒定和研究小種變異動態,有助于玉米生產中抗病品種的合理布局和抗病育種目標的確定。

本研究采用常規鑒別寄主鑒定方法,對從云南、貴州部分地區采集分離的玉米大斑病菌進行生理小種鑒定,以明確云貴地區近兩年來玉米大斑病菌小種變化及其對抗大斑病基因的致病水平。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2008年和2009年從云南8個市(州)16個縣(市)25個采樣點采集獲得30份玉米大斑病葉標樣;2008年從貴州3個市3個縣12個采樣點采集到15份玉米大斑病葉標樣。采用組織分離法分離大斑病菌,在PDA培養基上純化,純化后菌株保存至PDA斜面試管待用。

1.2 供試鑒別寄主

采用一套含 Ht單基因的自交系：OH 43H t1、黃早四H t2、黃早四 H t3、黃早四 H tN和黃早四(對照),進行小種鑒別接種。小種鑒定重復2次。

1.3 生理小種鑒定

將鑒別寄主分別播種于直徑15 cm的花盆內,置于溫室中,待出苗后每盆留苗3株。供試菌株接種至PDA平板培養基上,在25℃下培養12 d。玉米長至4葉期時進行接種。在培養的大斑病菌培養皿內加入適量無菌水,用毛筆小心將菌落上的大斑病菌孢子刷下,液體經細密的銅濾網過濾,然后轉至50 ML三角瓶中,配成濃度約為4×105個孢子/ML的懸浮液,向其中加入少許吐溫20,用高壓噴霧器進行噴霧接種,每菌株接5盆。接種后的植株在保濕間內26℃、95%濕度條件下保濕48 h,然后移到溫室進行正常管理。約在接種5 d后葉片出現明顯病斑,此時進行第1次調查。每次調查間隔3 d,共調查3次。

1.4 鑒定標準

鑒定以病斑反應類型為標準。R型：病斑初為黃綠色水浸狀條斑,后中間變褐成壞死斑,邊緣有明顯的較寬的黃色暈圈,病斑狹長,稱為褪綠斑;S型：病斑初為灰綠色水浸狀斑,后擴展為大的梭形斑,灰褐色,邊緣無明顯暈圈,稱為萎蔫斑。

1.5 生理小種命名

采用1989年 Leonard等建議的大斑病菌生理小種命名法,以無效寄主基因的序號作為該小種的名稱。

2 結果與分析

2.1 云貴兩地大斑病菌小種構成與主要致病小種分析

2.1.1 云南玉米大斑病菌生理小種構成與分布特點

在云南省的30個玉米大斑菌標樣中,共鑒定出8 個生理小種,即 ：12、13、3N 、123、12N 、13N 、23N 、123N。在30個標樣中,出現頻率最高的是小種123N號,占30.0%,小種23N號為23.3%,13N號小種為20.0%,123號小種為10.0%,12號小種為6.7%,而小種 13號、3N號、12N號均為 3.3%。13N、23N和123N 3個小種占出現頻率的73.3%,是構成云南玉米大斑病菌的主要致病群體。

不同生理小種在云南的分布情況表明(表1)：德宏州(潞西市)以12N 、23N 、123N 小種為主,保山市(騰沖、施甸 、昌寧)以3N 、13N 、23N 和 123N 號小種為主,大理州(大理、賓川)以123、13N、123N 為主,臨滄市(云縣、鳳慶)以 123N 為主,楚雄市(楚雄)以123N為主,普洱市(墨江)以13號小種為主,昆明市(宜良)以13N號小種為主,紅河州(彌勒)以12號小種為主,文山州(文山、馬關)以23N號小種為主。玉米大斑病菌在云南分布廣泛,尤其在云南西部靠近緬甸的德宏傣族景頗族自治州和保山市,小種類型多。在云南全境,小種分化明顯,種類多,毒力強,西部小種類型多,東部略少。

2.1.2 貴州玉米大斑病菌生理小種構成與分布

在貴州省分離獲得的15個玉米大斑病菌標樣中,鑒定出123、13N、23N和123N共4個生理小種。在4個小種中,123N號小種的出現頻率達53.3%,屬于貴州省的優勢小種,而13N和23N號小種分別為20.0%,小種123號出現頻率最低,為6.7%。

表1 玉米大斑病菌生理小種在云南的分布

對大斑病菌生理小種在貴州的分布分析表明(表2)：在玉米大斑病嚴重發生地區,畢節市(金沙縣 、畢節縣 、大方縣)以123、23N 、123N 為主,貴陽市以123N為主,遵義市(遵義縣)以 13N、23N、123N為主,其中在畢節地區,123N號小種所占比例很高,毒性很強。

表2 玉米大斑病菌生理小種在貴州的分布

在總體上,云南和貴州省的玉米大斑病菌生理小種分化明顯,小種類型較多,其中能夠同時克服4個抗大斑病的 H t基因的小種比例較高,貴州尤其明顯。

2.2 云南和貴州玉米大斑病菌小種毒力頻率分析

2.2.1 云南大斑病菌的毒力頻率

抗病基因的毒性頻率=有毒力菌株數/測定總菌株數 ×100%[15]。在所有供試云南菌株中,對Ht3抗性基因的毒性頻率最高,為90.0%,H t3基因表現為最低有效抗性;對H t1和H t2的毒性頻率最低,為 73.3%,H t1和 H t2有效抗性最高;對HtN的毒性頻率為80.0%。云南菌株對 H t單基因的毒性頻率為73.3%～90.0%;對 H t雙基因組合的毒性頻率為50.0%～76.7%;對H t 3基因組合的毒性頻率為33.3%～53.3%;對H t 4基因組合的毒性頻率為30.0%。

2.2.2 貴州大斑病菌的毒力頻率

在所有供試貴州菌株中,也是對 H t3抗性基因毒性頻率最高,為100%,對H t1和H t2的毒性頻率最低,均為80.0%,對H tN的毒性頻率為93.3%。貴州菌株對 H t單基因的毒性頻率為 80.0%～100%;對 H t雙基因組合的毒性頻率為 60.0%～93.3%;對H t 3基因組合的毒性頻率為53.3%～73.3%;對H t 4基因組合的毒性頻率為53.3%。

針對單一抗大斑病基因的菌株致病性檢測,兩省都表現為H t1和Ht2基因的相對有效抗性最高,而H t3基因最低。同時,隨著抗性基因組合從單基因、雙基因、3基因至4基因的發展,抗性的作用逐漸增強,病菌的毒性頻率下降。

3 結論與討論

3.1 云南、貴州玉米大斑病菌小種分化明顯,毒性明顯提高

與前人報道的鑒定結果相比較,云南和貴州在近年已出現了許多新的生理小種。

在云南,吳安國等報道主要生理小種為0號(原1號小種),出現頻率達96.8%,并在云南發現了23號小種(原3號小種)[16-17]。高衛東、戴法超等也報道云南存在1號小種[18]。此后10多年間,關于云南玉米大斑病菌小種的報道很少。本研究的結果與已往報道相比有如下特點：1)云南小種已復雜化。20世紀80年代末鑒定的小種主要以0號小種為主,即H t1、H t2、H t3單基因都具有良好的抗性。目前,云南的大斑病菌小種構成已很復雜,小種種類由過去的4個增加為8個,并由20世紀80年代針對單基因毒力的小種,演變為針對多基因毒力的小種;2)小種毒力增強。此次鑒定的30個菌株都能同時克服2～4個抗性基因的組合,且能同時克服3個或4個基因的小種比例達到了86.7%。云南玉米大斑病菌小種的演變,很可能與其復雜氣候和環境條件加速病菌變異、病菌間毒性重組存在相關性。

在貴州,蘭光變等的鑒定證明,黔西北特殊玉米生態區和遵義地區等的玉米大斑病菌存在著0號、1號和23號3個生理小種,0號是主要生理小種[19]。李曉等對四川、貴州兩省玉米大斑病菌小種的鑒定結果顯示,兩省以0號小種為主,占鑒定總數的74.1%,1號小種占11.8%,23號小種占4.3%,還有23N號小種存在,占 3.5%,其他未確定的占6.2%[20]。這些研究已表明,在貴州,玉米大斑病菌的小種是比較復雜的。本研究的結果與以往報道比較呈現如下特點：1)貴州北部地區的玉米大斑病菌生理小種也已發生明顯改變,123N已成為該區域的主要生理小種,同時出現了一些新的生理小種;2)貴州北部地區的小種毒力極強。在鑒定出的小種中,全部能夠克服3～4個抗性基因的組合,而毒性最強的123N小種所占比例達到53.3%。

3.2 云南、貴州玉米大斑病菌生理小種比較

自20世紀末以來,玉米大斑病在云南、貴州兩省有不斷擴大加重的趨勢,其生理小種也發生了很大的變化。相比之下,云南玉米大斑病菌的小種類型更多,而貴州大斑病菌小種雖不及云南多,但其總體的毒性卻強于云南的小種,這可能與兩地的地理和氣候差異、種植品種不同有關。但兩省小種有一個共同特點,即能克服4個抗性單基因組合的123N號小種正在上升,有可能成為兩地最主要的小種群體,這對云南和貴州的玉米生產是一個很大的威脅。

3.3 云貴地區玉米大斑病菌小種變異加快的原因

我國玉米大斑病菌生理小種的種類由20世紀90年代前以0號和1號小種為主,已演變為90年代中期至今各地小種組成日益復雜的狀況,在以4個主效抗性基因為基礎的鑒別體系中,已鑒定出所有可能的16種毒力類型小種。玉米大斑病菌小種變異原因主要有4個：基因突變、生殖方式、選擇作用和基因漂移[21]。云南和貴州地區小種變異較快、毒力明顯較其他地區的小種強,可能有如下的成因：早在1985年,吳安國已在云南的宜良和云縣發現了23號小種(原文為舊小種命名系統中的3號小種)的存在[17],云南是我國最早發現該小種的地區。23號小種能夠克服 H t2、H t3基因,經過20多年的進化,云南大斑病菌之間通過一系列的基因重組,完全能夠產生新的小種。這種基因重組的結果,最終表現為云南地區大斑病菌小種的毒力結構以及針對不同抗大斑病基因組合的毒性頻率之高都不同于其他大斑病發生地區;此外,云貴玉米生產區域獨特的地理條件,即處于低緯度高原地區,氣候的垂直變化顯著,年溫差小,日溫差大,降水充沛,濕度高,山地玉米常處于云霧之中,大斑病發生充分,病菌完成一個世代周期短,能夠積累更多的遺傳變異;高海拔地區在晴日條件下,紫外線輻射劇烈,極易誘發病菌的突變,這些突變體完全可以通過重組形成新的具有高毒力的小種;近年來,一些北方培育的玉米品種進入云南和貴州,在增加玉米抗性遺傳多樣性的同時,也可能對該地區的病菌產生抗性壓力,促其加快遺傳變異,小種間基因交流加強,這些都為新小種的形成提供了有利條件。目前,這些對病菌小種變異成因的推斷還缺乏科學數據的證明,但來自生產中的信息已證明了云南地區玉米大斑病病菌生理小種發生了改變：目前在云南省種植面積最大的品種‘會單4號’以及‘保玉7號’,在審定時均為高抗大斑病,但在2004年,在一些地區卻表現為高感大斑病(新華社專稿,2004-10-19),2009年作者的調查也表明,‘會單4號’在田間發病嚴重,達到感病至高感水平。

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