橡膠樹白粉病殺菌劑生物測定接種方法研究

楊意伯, 譚志瓊, 鄭服叢, 張榮意

(海南大學環境與植物保護學院,儋州 571737)

橡膠樹粉孢(Oid iuMheveae Steinm.)危害橡膠樹嫩葉、嫩梢及花序,造成落葉、枝枯、果實失收,嚴重威脅我國橡膠產量[1]。目前在防治上仍以化學防治為主,由于病原菌為專性寄生菌,殺菌劑防效測定只能在活體上進行,因此接種方法和接種量關系到試驗結果的準確性和可比性。國內外對橡膠樹白粉病菌接種方法均無具體描述,亦未明確接種量[2-3]。作者參考前人對其他作物白粉病菌生物測定技術的研究[4-7],對抖粉法、涂抹法和噴霧法等3種接種方法進行比較,并測定了噴霧法的適宜接種量,旨在進行橡膠樹白粉病殺菌劑室內盆栽毒力測定。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

橡膠樹粉孢(Oid iuMheveae)采自海南省儋州那大地區,將野外自然發病的橡膠樹葉帶回實驗室,采用單斑分離法得到純菌株。輕輕彈去病葉表面的分生孢子后培養1 d,使病原菌長出新鮮分生孢子。

1.2 供試植物

半年生橡膠樹芽接幼苗,品系為‘熱研 7-33-97’,塑料棚隔離種植。待幼苗長出寬度為2～3 cm的健康古銅色嫩葉后,將生長狀態較一致的幼苗移入室內備用。

1.3 供試藥劑

吐溫20(分析純)由國藥集團化學試劑有限公司生產,15%三唑酮可濕性粉劑由上海升聯化工有限公司生產。

1.4 比較不同接種方法對寄主發病程度的影響

1.4.1 抖粉法

剪下2片表面布滿新鮮病斑的病葉,葉面朝向健康幼苗,手指輕彈葉背使分生孢子飛出,重復3次,每重復接種1株,對照不接種。將幼苗置于18～25℃,相對濕度70%～80%室內培養,光照12 h/d。接種后第8～11天調查病情,計算變異系數[8]。

葉片病情分級標準：對《橡膠樹白粉病測報技術規程》的分級標準進行了修改,使之更適合本研究實際情況(表1)。

表1 橡膠樹白粉病葉片病情分級標準

1.4.2 涂抹法

用直徑0.3 cm的玻璃棒蘸取新鮮分生孢子接種于健康嫩葉上,重復3次,每重復接種1株,對照不接種。室內條件同1.4.1,計算變異系數。

1.4.3 噴霧法

用毛筆將新鮮分生孢子刷入0.05%吐溫20水溶液,混合均勻后用血球計數板在10×10倍顯微鏡下鏡檢,調整孢子濃度為10×104個/ML。用小型噴霧器將孢子懸浮液噴灑在健康嫩葉上,使霧滴布滿葉面但不滴落,重復3次,每重復接種1株,對照不接種。室內條件同1.4.2,計算變異系數。

1.5 抖粉法與噴霧法測定三唑酮EC50的穩定性

抖粉法：用蒸餾水將15%三唑酮可濕性粉劑配制成系列濃度,分別裝入小型噴霧器噴施橡膠幼苗,對照噴施蒸餾水,每處理接種1株,重復3次。噴藥時,使霧滴布滿葉面但不滴落。噴藥后1 d采用抖粉法接種。室內條件同1.4.1,計算相對防效[10]。藥液濃度以對數表示,為x值;查表將防治效果換算成幾率值,為y值,以此計算毒力回歸方程y=a+b x、EC50和相關系數[10]。該試驗重復做3次,分別得到3個EC50值,計算變異系數。

噴霧法：藥劑配制方法同抖粉法。對照噴施蒸餾水,每處理接種1株,重復3次。噴藥后1 d將濃度為10×104個/ML的孢子懸浮液噴霧接種。室內條件同1.4.1,計算相對防效、毒力回歸方程、EC50和相關系數。該試驗重復做 3次,分別得到 3個EC50值,計算變異系數。

1.6 噴霧法接種量對病情指數的影響

用毛筆將新鮮分生孢子刷入0.05%吐溫20水溶液,混合均勻后用血球計數板在10×10倍顯微鏡下鏡檢,將孢子濃度調整為 16×104、14.5×104、13.3×104、12 ×104、10 ×104、9 ×104、8 ×104、7 ×104、6 ×104、5×104、4×104、3 ×104、2×104、1 ×104個/ML。用小型噴霧器將各濃度孢子懸浮液噴霧接種健康幼苗,每處理接種1株,重復3次。室內條件同1.4.1,接種后第8～11天調查病情。

1.7 噴霧法接種量對防效測定結果的影響

藥劑配制方法同抖粉法。對照噴施蒸餾水。噴藥1 d后,配制不同濃度的分生孢子懸浮液(同1.6)并噴霧接種施過藥的幼苗,每處理接種1株,重復3次。室內條件同1.4.1,調查病情,計算相對防效。

2 結果與分析

2.1 不同接種方法寄主發病程度比較

若以病株為調查對象,抖粉法、涂抹法、噴霧法這3種接種方法都能使寄主發病,發病率皆為100%;若以葉片為調查對象,這3種方法的發病輕重程度則有相當大的差異(圖1)。采用涂抹法接種,有的葉片發病輕微,有的葉片病斑面積超過葉面積一半;抖粉法接種的大多數葉片發病嚴重,病斑之間連成一片,覆蓋整個葉面;噴霧法接種的葉片也有很多病斑,但發病嚴重程度稍低于抖粉法。從病斑在病葉上的分布情況看,涂抹法和抖粉法都存在大量病斑集中在葉片一側而另一側病斑很少的問題,即接種不均勻;而噴霧法的病葉無論發病輕重,病斑都能均勻分布于葉面。

不同接種方法在葉片發病率與發病嚴重度上的差異可用病情指數來量化。如表2所示,涂抹法接種的病情指數最高為85.7,最低為32.6,相差近3倍;變異系數最高,達到44.5%,分別為抖粉法和噴霧法的4倍和7倍,可見涂抹法重復性最差,而且每片葉都要人工涂抹,操作繁瑣,因此不適合作為藥效測定的接種方法。抖粉法和噴霧法都能使寄主嚴重發病,重復間病情指數范圍都在80～100,平均值相同,前者的標準差和變異系數都較高,但與后者無顯著差異,說明采用這兩種方法接種的病情指數比較穩定。

圖1 不同接種方法對橡膠樹葉片發病嚴重度的影響

表2 不同接種方法對橡膠白粉病病情指數的影響1)

2.2 抖粉法與噴霧法測定三唑酮EC50的穩定性

試驗結果見表3。噴霧法接種重復間EC50值分別為 5.2、8.4、9.8mg/L,變異系數為30.6%,遠低于抖粉法的53.3%,說明噴霧法接種測定的EC50值重復間變化較小,穩定性較好;抖粉法接種測定的EC50值波動較大,且毒力回歸方程的相關系數較低,說明相關性較差。不同重復之間即使用相同濃度的藥劑處理,防治效果也存在較大差異(表4),這和前人觀察到的現象一致[5]。

表3 抖粉法和噴霧法接種測定15%三唑酮WP的EC50

2.3 噴霧法接種量對病情指數的影響

在接種量(1～16)×104個/ML范圍內,病情指數隨著接種量的增加而遞增(圖2);當接種量小于6×104個/ML時,病指增加較快,超過 6×104個/ML后,病指達到90以上,隨著接種量的增加而緩慢上升,各處理間無顯著差異;接種量達(8～16)×104個/ML的病情指數均接近100,增長趨向停止,增長曲線呈水平狀。

表4 抖粉法和噴霧法接種同濃度不同重復間三唑酮的防效比較

圖2 接種量對橡膠白粉病病情指數的影響

2.4 噴霧法接種量對防效測定結果的影響

10mg/L三唑酮對病原菌的防治效果隨著接種量的變化而變化(圖3);接種量增大,防治效果漸趨下降,最低和最高接種量相差16倍,防效相差2倍以上。從圖中可看出,防治效果的變化有3個較穩定的階段：接種量大小范圍分別為(1～4)×104個/ML、(5～10)×104個/ML、(12～ 16)×104個/ML時,范圍內各處理的防治效果無顯著差異。接種量(1～4)×104個/ML的對照病情指數大多在65～75(圖2),藥劑處理后的幾個重復發病程度變化大,導致防效平均值的標準差很高(圖3),不能真實反映藥劑的抑菌活性。接種量(5～10)×104個/ML的對照病情指數達90以上,防治效果72.2%～63.4%,處理間的防效差異不顯著,標準差也相近;接種量 12×104個/ML與 10×104個/ML的防效差異較顯著,隨著接種量繼續增大,防治效果則下降較快,(12～16)×104個/ML的對照病情指數接近100,但防效為56.9%～40.6%,處理間的降幅較大。綜上所述,接種量控制在(5～10)×104個/ML,防效測定結果較穩定。

圖3 病菌接種量對10mg/L三唑酮防效測定的影響

3 討論與結論

其他作物白粉菌的接種方法中,馬嚴明[4]和朱振家[7]將分生孢子吹至葉面接種,賈忠明[6]使用毛筆蘸取孢子粉或孢子懸浮液接種,李興紅[11]等采用孢子懸浮液噴霧接種。由于不同實驗室的條件不同,如選用的品種、寄主栽培條件及發病培養條件的差異,最適接種量都可能有所不同,因此在測定前首先要確定接種方法和接種量[4]。

S.Liyanage[12]等的研究結果表明,噴射微水滴顯然不影響分生孢子萌發,只有在分生孢子與自由水接觸一段時間或有大水滴時水才是有害的。因此噴霧法能使寄主發病均勻,便于檢查結果和統計分析;缺點是在具體操作中能否噴施均勻取決于試驗人員是否有經驗和掌握技巧。在接種前試噴幾次,增加熟練程度,以霧滴布滿葉面但不滴落為宜,可避免接種不均。

接種量過低和過高都難以真實反映藥劑的抑菌活性[4]。本試驗發現接種量對橡膠樹白粉病藥劑防效測定結果有一定影響,與馬嚴明對小麥白粉病菌的研究結果類似[4]。但前人試驗結果的變化較顯著,接種量相差3倍,EC50值相差達9倍,這可能與前人采用的試驗材料為2.5～3 cm的離體葉段以及可精細控制的環境條件有關。前人測定的是EC50值,而作者為了縮短時間,改以10 mg/L三唑酮的相對防效作為指標,是否能真實反映接種量對生測結果的影響,有待進一步研究。在實際操作中,為了使對照病情指數變化不太大,作者每次配制分生孢子懸浮液時都將濃度調整為(8～10)×104個/ML。

綜上所述,在進行殺菌劑對橡膠樹白粉病菌的室內盆栽毒力測定時,應使用分生孢子懸浮液噴霧接種,接種量以5×104～10×104個/ML為宜。

[1]黃朝豪.熱帶作物病理學[M].北京：中國農業出版社,1997.

[2]華南熱帶作物科學研究院植物保護研究所.橡膠樹白粉病化學防治研究[J].熱帶作物學報,1985,6(1)：58.

[3]Radziah N Z,HashiMI,Shamsu ri MH.Effect of selected fungicides on OidiuMheveae and Cor ticiuMsalmonicolor affecting rubber in west Malaysia[J].Indian Jou rnal of Natu ral Rubber Research,1992,5(1-2)：66-72.

[4]馬嚴明.小麥白粉病對三唑酮抗藥性檢測技術標準化研究[D].南京.南京農業大學,2000：15-20.

[5]郝永娟,王萬立,劉春艷,等.黃瓜白粉病生測技術的改進[J].天津農業科學,2005,11(3)：37-40.

[6]賈忠明,劉峰,慕衛,等.黃瓜白粉病菌接種及對殺菌劑敏感性測定方法[J].植物保護學報,2006,33(1)：99-103.

[7]朱振家.甜瓜抗白粉病化學誘導物篩選及誘導抗性機理研究[D].蘭州：甘肅農業大學,2007：12-14.

[8]方中達.植病研究方法[M].第3版.北京：中國農業出版社,1998.

[9]NY/T 1089-2006,橡膠樹白粉病測報技術規程[S].

[10]駱焱平,鄭服叢.農藥學科群實驗指導[M].海口：海南出版社,2008.

[11]李興紅,嚴紅.瓜類白粉病菌對新型殺菌劑室內抗藥性誘導研究[C]∥中國植物病害化學防治研究(第 3卷).北京：中國農業科學技術出版社,2002.

[12]張開明.橡膠樹白粉病菌的生物學[J].世界熱帶農業信息,1987(1)：19-25.