橡膠樹(shù)白粉病殺菌劑生物測(cè)定接種方法研究

楊意伯, 譚志瓊, 鄭服叢, 張榮意

(海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院,儋州 571737)

橡膠樹(shù)粉孢(Oid iuMheveae Steinm.)危害橡膠樹(shù)嫩葉、嫩梢及花序,造成落葉、枝枯、果實(shí)失收,嚴(yán)重威脅我國(guó)橡膠產(chǎn)量[1]。目前在防治上仍以化學(xué)防治為主,由于病原菌為專(zhuān)性寄生菌,殺菌劑防效測(cè)定只能在活體上進(jìn)行,因此接種方法和接種量關(guān)系到試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。國(guó)內(nèi)外對(duì)橡膠樹(shù)白粉病菌接種方法均無(wú)具體描述,亦未明確接種量[2-3]。作者參考前人對(duì)其他作物白粉病菌生物測(cè)定技術(shù)的研究[4-7],對(duì)抖粉法、涂抹法和噴霧法等3種接種方法進(jìn)行比較,并測(cè)定了噴霧法的適宜接種量,旨在進(jìn)行橡膠樹(shù)白粉病殺菌劑室內(nèi)盆栽毒力測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

橡膠樹(shù)粉孢(Oid iuMheveae)采自海南省儋州那大地區(qū),將野外自然發(fā)病的橡膠樹(shù)葉帶回實(shí)驗(yàn)室,采用單斑分離法得到純菌株。輕輕彈去病葉表面的分生孢子后培養(yǎng)1 d,使病原菌長(zhǎng)出新鮮分生孢子。

1.2 供試植物

半年生橡膠樹(shù)芽接幼苗,品系為‘熱研 7-33-97’,塑料棚隔離種植。待幼苗長(zhǎng)出寬度為2～3 cm的健康古銅色嫩葉后,將生長(zhǎng)狀態(tài)較一致的幼苗移入室內(nèi)備用。

1.3 供試藥劑

吐溫20(分析純)由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn),15%三唑酮可濕性粉劑由上海升聯(lián)化工有限公司生產(chǎn)。

1.4 比較不同接種方法對(duì)寄主發(fā)病程度的影響

1.4.1 抖粉法

剪下2片表面布滿新鮮病斑的病葉,葉面朝向健康幼苗,手指輕彈葉背使分生孢子飛出,重復(fù)3次,每重復(fù)接種1株,對(duì)照不接種。將幼苗置于18～25℃,相對(duì)濕度70%～80%室內(nèi)培養(yǎng),光照12 h/d。接種后第8～11天調(diào)查病情,計(jì)算變異系數(shù)[8]。

葉片病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)《橡膠樹(shù)白粉病測(cè)報(bào)技術(shù)規(guī)程》的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修改,使之更適合本研究實(shí)際情況(表1)。

表1 橡膠樹(shù)白粉病葉片病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.4.2 涂抹法

用直徑0.3 cm的玻璃棒蘸取新鮮分生孢子接種于健康嫩葉上,重復(fù)3次,每重復(fù)接種1株,對(duì)照不接種。室內(nèi)條件同1.4.1,計(jì)算變異系數(shù)。

1.4.3 噴霧法

用毛筆將新鮮分生孢子刷入0.05%吐溫20水溶液,混合均勻后用血球計(jì)數(shù)板在10×10倍顯微鏡下鏡檢,調(diào)整孢子濃度為10×104個(gè)/ML。用小型噴霧器將孢子懸浮液噴灑在健康嫩葉上,使霧滴布滿葉面但不滴落,重復(fù)3次,每重復(fù)接種1株,對(duì)照不接種。室內(nèi)條件同1.4.2,計(jì)算變異系數(shù)。

1.5 抖粉法與噴霧法測(cè)定三唑酮EC50的穩(wěn)定性

抖粉法：用蒸餾水將15%三唑酮可濕性粉劑配制成系列濃度,分別裝入小型噴霧器噴施橡膠幼苗,對(duì)照噴施蒸餾水,每處理接種1株,重復(fù)3次。噴藥時(shí),使霧滴布滿葉面但不滴落。噴藥后1 d采用抖粉法接種。室內(nèi)條件同1.4.1,計(jì)算相對(duì)防效[10]。藥液濃度以對(duì)數(shù)表示,為x值;查表將防治效果換算成幾率值,為y值,以此計(jì)算毒力回歸方程y=a+b x、EC50和相關(guān)系數(shù)[10]。該試驗(yàn)重復(fù)做3次,分別得到3個(gè)EC50值,計(jì)算變異系數(shù)。

噴霧法：藥劑配制方法同抖粉法。對(duì)照噴施蒸餾水,每處理接種1株,重復(fù)3次。噴藥后1 d將濃度為10×104個(gè)/ML的孢子懸浮液噴霧接種。室內(nèi)條件同1.4.1,計(jì)算相對(duì)防效、毒力回歸方程、EC50和相關(guān)系數(shù)。該試驗(yàn)重復(fù)做 3次,分別得到 3個(gè)EC50值,計(jì)算變異系數(shù)。

1.6 噴霧法接種量對(duì)病情指數(shù)的影響

用毛筆將新鮮分生孢子刷入0.05%吐溫20水溶液,混合均勻后用血球計(jì)數(shù)板在10×10倍顯微鏡下鏡檢,將孢子濃度調(diào)整為 16×104、14.5×104、13.3×104、12 ×104、10 ×104、9 ×104、8 ×104、7 ×104、6 ×104、5×104、4×104、3 ×104、2×104、1 ×104個(gè)/ML。用小型噴霧器將各濃度孢子懸浮液噴霧接種健康幼苗,每處理接種1株,重復(fù)3次。室內(nèi)條件同1.4.1,接種后第8～11天調(diào)查病情。

1.7 噴霧法接種量對(duì)防效測(cè)定結(jié)果的影響

藥劑配制方法同抖粉法。對(duì)照噴施蒸餾水。噴藥1 d后,配制不同濃度的分生孢子懸浮液(同1.6)并噴霧接種施過(guò)藥的幼苗,每處理接種1株,重復(fù)3次。室內(nèi)條件同1.4.1,調(diào)查病情,計(jì)算相對(duì)防效。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種方法寄主發(fā)病程度比較

若以病株為調(diào)查對(duì)象,抖粉法、涂抹法、噴霧法這3種接種方法都能使寄主發(fā)病,發(fā)病率皆為100%;若以葉片為調(diào)查對(duì)象,這3種方法的發(fā)病輕重程度則有相當(dāng)大的差異(圖1)。采用涂抹法接種,有的葉片發(fā)病輕微,有的葉片病斑面積超過(guò)葉面積一半;抖粉法接種的大多數(shù)葉片發(fā)病嚴(yán)重,病斑之間連成一片,覆蓋整個(gè)葉面;噴霧法接種的葉片也有很多病斑,但發(fā)病嚴(yán)重程度稍低于抖粉法。從病斑在病葉上的分布情況看,涂抹法和抖粉法都存在大量病斑集中在葉片一側(cè)而另一側(cè)病斑很少的問(wèn)題,即接種不均勻;而噴霧法的病葉無(wú)論發(fā)病輕重,病斑都能均勻分布于葉面。

不同接種方法在葉片發(fā)病率與發(fā)病嚴(yán)重度上的差異可用病情指數(shù)來(lái)量化。如表2所示,涂抹法接種的病情指數(shù)最高為85.7,最低為32.6,相差近3倍;變異系數(shù)最高,達(dá)到44.5%,分別為抖粉法和噴霧法的4倍和7倍,可見(jiàn)涂抹法重復(fù)性最差,而且每片葉都要人工涂抹,操作繁瑣,因此不適合作為藥效測(cè)定的接種方法。抖粉法和噴霧法都能使寄主嚴(yán)重發(fā)病,重復(fù)間病情指數(shù)范圍都在80～100,平均值相同,前者的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)都較高,但與后者無(wú)顯著差異,說(shuō)明采用這兩種方法接種的病情指數(shù)比較穩(wěn)定。

圖1 不同接種方法對(duì)橡膠樹(shù)葉片發(fā)病嚴(yán)重度的影響

表2 不同接種方法對(duì)橡膠白粉病病情指數(shù)的影響1)

2.2 抖粉法與噴霧法測(cè)定三唑酮EC50的穩(wěn)定性

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。噴霧法接種重復(fù)間EC50值分別為 5.2、8.4、9.8mg/L,變異系數(shù)為30.6%,遠(yuǎn)低于抖粉法的53.3%,說(shuō)明噴霧法接種測(cè)定的EC50值重復(fù)間變化較小,穩(wěn)定性較好;抖粉法接種測(cè)定的EC50值波動(dòng)較大,且毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)較低,說(shuō)明相關(guān)性較差。不同重復(fù)之間即使用相同濃度的藥劑處理,防治效果也存在較大差異(表4),這和前人觀察到的現(xiàn)象一致[5]。

表3 抖粉法和噴霧法接種測(cè)定15%三唑酮WP的EC50

2.3 噴霧法接種量對(duì)病情指數(shù)的影響

在接種量(1～16)×104個(gè)/ML范圍內(nèi),病情指數(shù)隨著接種量的增加而遞增(圖2);當(dāng)接種量小于6×104個(gè)/ML時(shí),病指增加較快,超過(guò) 6×104個(gè)/ML后,病指達(dá)到90以上,隨著接種量的增加而緩慢上升,各處理間無(wú)顯著差異;接種量達(dá)(8～16)×104個(gè)/ML的病情指數(shù)均接近100,增長(zhǎng)趨向停止,增長(zhǎng)曲線呈水平狀。

表4 抖粉法和噴霧法接種同濃度不同重復(fù)間三唑酮的防效比較

圖2 接種量對(duì)橡膠白粉病病情指數(shù)的影響

2.4 噴霧法接種量對(duì)防效測(cè)定結(jié)果的影響

10mg/L三唑酮對(duì)病原菌的防治效果隨著接種量的變化而變化(圖3);接種量增大,防治效果漸趨下降,最低和最高接種量相差16倍,防效相差2倍以上。從圖中可看出,防治效果的變化有3個(gè)較穩(wěn)定的階段：接種量大小范圍分別為(1～4)×104個(gè)/ML、(5～10)×104個(gè)/ML、(12～ 16)×104個(gè)/ML時(shí),范圍內(nèi)各處理的防治效果無(wú)顯著差異。接種量(1～4)×104個(gè)/ML的對(duì)照病情指數(shù)大多在65～75(圖2),藥劑處理后的幾個(gè)重復(fù)發(fā)病程度變化大,導(dǎo)致防效平均值的標(biāo)準(zhǔn)差很高(圖3),不能真實(shí)反映藥劑的抑菌活性。接種量(5～10)×104個(gè)/ML的對(duì)照病情指數(shù)達(dá)90以上,防治效果72.2%～63.4%,處理間的防效差異不顯著,標(biāo)準(zhǔn)差也相近;接種量 12×104個(gè)/ML與 10×104個(gè)/ML的防效差異較顯著,隨著接種量繼續(xù)增大,防治效果則下降較快,(12～16)×104個(gè)/ML的對(duì)照病情指數(shù)接近100,但防效為56.9%～40.6%,處理間的降幅較大。綜上所述,接種量控制在(5～10)×104個(gè)/ML,防效測(cè)定結(jié)果較穩(wěn)定。

圖3 病菌接種量對(duì)10mg/L三唑酮防效測(cè)定的影響

3 討論與結(jié)論

其他作物白粉菌的接種方法中,馬嚴(yán)明[4]和朱振家[7]將分生孢子吹至葉面接種,賈忠明[6]使用毛筆蘸取孢子粉或孢子懸浮液接種,李興紅[11]等采用孢子懸浮液噴霧接種。由于不同實(shí)驗(yàn)室的條件不同,如選用的品種、寄主栽培條件及發(fā)病培養(yǎng)條件的差異,最適接種量都可能有所不同,因此在測(cè)定前首先要確定接種方法和接種量[4]。

S.Liyanage[12]等的研究結(jié)果表明,噴射微水滴顯然不影響分生孢子萌發(fā),只有在分生孢子與自由水接觸一段時(shí)間或有大水滴時(shí)水才是有害的。因此噴霧法能使寄主發(fā)病均勻,便于檢查結(jié)果和統(tǒng)計(jì)分析;缺點(diǎn)是在具體操作中能否噴施均勻取決于試驗(yàn)人員是否有經(jīng)驗(yàn)和掌握技巧。在接種前試噴幾次,增加熟練程度,以霧滴布滿葉面但不滴落為宜,可避免接種不均。

接種量過(guò)低和過(guò)高都難以真實(shí)反映藥劑的抑菌活性[4]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種量對(duì)橡膠樹(shù)白粉病藥劑防效測(cè)定結(jié)果有一定影響,與馬嚴(yán)明對(duì)小麥白粉病菌的研究結(jié)果類(lèi)似[4]。但前人試驗(yàn)結(jié)果的變化較顯著,接種量相差3倍,EC50值相差達(dá)9倍,這可能與前人采用的試驗(yàn)材料為2.5～3 cm的離體葉段以及可精細(xì)控制的環(huán)境條件有關(guān)。前人測(cè)定的是EC50值,而作者為了縮短時(shí)間,改以10 mg/L三唑酮的相對(duì)防效作為指標(biāo),是否能真實(shí)反映接種量對(duì)生測(cè)結(jié)果的影響,有待進(jìn)一步研究。在實(shí)際操作中,為了使對(duì)照病情指數(shù)變化不太大,作者每次配制分生孢子懸浮液時(shí)都將濃度調(diào)整為(8～10)×104個(gè)/ML。

綜上所述,在進(jìn)行殺菌劑對(duì)橡膠樹(shù)白粉病菌的室內(nèi)盆栽毒力測(cè)定時(shí),應(yīng)使用分生孢子懸浮液噴霧接種,接種量以5×104～10×104個(gè)/ML為宜。

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