Plant MetGen MAP數(shù)據(jù)庫分析水稻表達譜芯片數(shù)據(jù)的方法初探

劉 峙, 劉 莉, 付月靈, 張文蔚, 簡桂良, 齊放軍

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室,北京 100193)

隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展和功能基因組學(xué)的興起,許多DNA內(nèi)在的信息需要我們?nèi)プ⑨尅＿@就需要處理大量的信息,包括大規(guī)模的DNA序列解析、比對以及基因功能的鑒別等[1]。基因芯片技術(shù)正是滿足了這種需求,才得以快速發(fā)展。Fodor等首先提出了DNA芯片的概念[2]。經(jīng)過十多年的發(fā)展,該技術(shù)已逐漸發(fā)展成熟并獲得廣泛應(yīng)用。近年來,基因芯片已應(yīng)用于水稻基因表達譜的分析[3-5]。科學(xué)地解讀基因芯片數(shù)據(jù),才能將數(shù)據(jù)結(jié)果與生命活動聯(lián)系起來,進而闡明基因表達與生命活動的規(guī)律。

Plant MetGenMAP是美國康奈爾大學(xué)Boyce ThoMpson植物研究所開發(fā)的一個在線分析系統(tǒng),可以分析大量的基因表達數(shù)據(jù),并揭示基因表達量、代謝途徑及生命活動的變化情況[6]。本研究以A ffymetrix的表達譜芯片的數(shù)據(jù)為例,利用 Plant MetGenMAP數(shù)據(jù)庫,對水稻受病原菌侵染后基因表達量及代謝途徑的變化進行了初步的分析,為分析基因芯片數(shù)據(jù)提供了一種新方法。

1 材料與方法

1.1 水稻的培養(yǎng)

選擇飽滿一致的水稻(Oryzae sativa Linn.cv.Nipponbare)種子,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%H2O2消毒30 min,蒸餾水沖洗數(shù)次,放入26℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽3 d。選擇發(fā)芽一致的種子播于盛有營養(yǎng)土的塑料盆中,放入光照培養(yǎng)箱,在28℃/16 h光照,24℃/8 h黑暗,濕度為75%的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)至三葉期接種。

1.2 菌株的培養(yǎng)

挑取水稻白葉枯病菌JxoI(Xanthomonas oryzae pv.oryzae;JxoI)、非寄主病原菌Xv5(X.caMpestrispv.vesicatoria;Xv5)的單菌落,分別培養(yǎng)于4 ML LB液體培養(yǎng)基中,28℃,200 r/min,培養(yǎng)48 h,取1ML培養(yǎng)液加入到50ML LB液體培養(yǎng)基中,28℃,200 r/min,培養(yǎng)6 h至對數(shù)生長期。

1.3 噴霧接種和樣品采集

培養(yǎng)好的菌液濃度調(diào)至108cfu/ML,噴霧接種水稻,以噴清水作對照。接種后的水稻置于飽和濕度、30℃、暗光條件下培養(yǎng)。

接菌24 h后取樣。采集接菌后的水稻葉片,迅速用液氮凍存,-80℃保存。

1.4 總RNA提取

水稻葉片總 RNA提取采用熱酚法[7],乙醇洗滌、干燥,得到 RNA樣品。

1.5 芯片測試

各處理的RNA樣品委托博奧生物芯片公司,用A ffyMetrix水稻全基因組芯片,進行表達譜的測試。

1.6 Plant MetGenMAP數(shù)據(jù)庫分析

所采用的水稻A ffymetrix芯片檢測結(jié)果數(shù)據(jù)如表1所列。本研究以3組A ffymetrix表達譜檢測結(jié)果Jxo I vs清水、Xv5 vs清水及Jxo I vs Xv5為對象,分析A ffymetrix表達譜芯片的數(shù)據(jù)。Jxo I vs清水表示噴清水的水稻為對照材料,接種Jxo I的水稻為試驗材料,進行兩兩比較,從而得到基因表達量的變化倍數(shù)。Xv5 vs清水、Jxo I vs Xv5代表含義與此類同。登錄 Plant MetGenMAP(http：∥bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/MetGenMAP/home.cgi),將3組(Jxo I vs清水、Xv5 vs清水及Jxo I vs Xv5)試驗數(shù)據(jù)上傳至Plant MetGenMAP數(shù)據(jù)庫。該試驗數(shù)據(jù)的格式為文本文檔格式,內(nèi)容包括探針編號(如OS.53924.1.S1_at)及該基因表達量的變化倍數(shù)(fold change)。利用該數(shù)據(jù)庫分析各組數(shù)據(jù)的測試結(jié)果。

表1 Affymetrix芯片檢測結(jié)果

2 數(shù)據(jù)分析結(jié)果

2.1 基因表達量的變化情況

在3組試驗中,基因表達量的變化情況見表2。以表達量上調(diào)2倍及以上(fold change≥2)的基因為表達量顯著上調(diào)的基因,表達量下調(diào)2倍及以上(fo ld change≤-2)的基因為表達量顯著下調(diào)的基因。

表2 基因表達量的變化

2.2 PlantMetGenMAP數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果

2.2.1 代謝途徑的變化情況

利用Plant MetGenMAP中“changed pathway”分析功能,可以分析3組試驗中水稻代謝途徑的變化情況。從表3中可以發(fā)現(xiàn),水稻受白葉枯病菌Jxo I及非寄主菌Xv5侵染后,代謝途徑的變化存在顯著差異。白葉枯病菌JxoI引起的表達量下調(diào)的代謝途徑數(shù)量多于上調(diào)的數(shù)量,而非寄主菌Xv5引起的表達量上調(diào)的代謝途徑數(shù)量遠多于下調(diào)的數(shù)量。這大致反映了白葉枯病菌JxoI與水稻發(fā)生親和性互作,與防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)的代謝途徑主要受到抑制,而非寄主菌Xv5與水稻發(fā)生非親和性互作,與防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)的代謝途徑主要被激活的狀況。

表3 代謝途徑變化情況

利用Plant MetGenMAP數(shù)據(jù)庫,還可以分析某一代謝途徑中各個基因表達量的變化情況。以水楊酸合成途徑為例,在JxoI vs清水中,水楊酸合成途徑上調(diào)表達,其中1個基因表達量上調(diào)2倍以上,5個基因表達量在0～2倍之間;在Xv5 vs清水中,水楊酸合成途徑也上調(diào)表達,其中1個基因表達量上調(diào)2倍以上,2個基因表達量在0～2倍之間。具體的變化情況見圖1,圖中黑色圖框表示該基因表達上調(diào)2倍以上,灰色圖框表示該基因表達量在0～2倍之間。通過比較發(fā)現(xiàn),OS.10930.1.S1_at探針標(biāo)記的基因(LOC_Os02g41670)在兩組試驗中表達量均上調(diào)2倍以上(在JxoI vs清水中上調(diào)2.52倍,在Xv5 vs清水中上調(diào)3.01倍)。由PlantMetGenMAP注釋信息得知,該基因(LOC_Os02g41670)編碼苯丙氨酸解氨酶,參與苯基丙酸類合成途徑起始階段(phenylpropanoid biosynthesis,initial reactions)、水楊酸合成途徑(salicylate biosynthesis)及軟木脂合成途徑(suberin biosynthesis),在應(yīng)答外界脅迫及刺激等生命活動中發(fā)揮作用。這一分析結(jié)果與苯丙氨酸解氨酶在植物抗病過程中發(fā)揮的作用完全一致。在植物防衛(wèi)反應(yīng)次生代謝途徑中,苯丙烷類代謝途徑起著十分重要的作用,可形成一些次生抗病物質(zhì),如植保素、木質(zhì)素等,而苯丙氨酸解氨酶是這一途徑的關(guān)鍵酶和限速酶[8-15]。這一結(jié)果說明利用PlantMetGenMAP數(shù)據(jù)庫可以準(zhǔn)確地分析水稻抗病代謝途徑的變化情況及關(guān)鍵的調(diào)控基因。

圖1 水楊酸合成途徑各基因表達變化情況示意圖

2.2.2 Gene Ontology分析

利用PlantMetGenMAP數(shù)據(jù)庫中GeneOntology(GO)分析功能,以JxoI vs清水為例,進行聚類分析,檢查基因的富集情況,分類依據(jù)為差異基因構(gòu)成的細胞組分(cellu lar components)及參與的生物學(xué)過程(biological process)。在JxoI vs清水中,差異基因的富集情況見圖2。基因富集分析揭示了差異基因在各個細胞組成中的表達情況及參與的生物學(xué)過程。通過GO分析差異基因的富集情況,有助于更好地了解水稻受病原菌侵染后,基因表達的變化規(guī)律。例如,在本例中,通過GO進行聚類分析,發(fā)現(xiàn)水稻受白葉枯病原菌JxoI侵染后,差異表達的基因多是參與新陳代謝過程(metabolic process)、細胞過程(cellular process)、應(yīng)答刺激(response to stimulus和 abiotic stimulus)等。這為我們進一步研究水稻與病原菌互作的分子機制、探尋水稻抗/感病分子機理、發(fā)掘新的抗病基因奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

基因芯片技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在水稻基因組的研究中。相對于幾種傳統(tǒng)的用于檢測基因表達水平的方法,如 RT-PCR、Northern雜交、MRNA 差別顯示等,高通量檢測是基因表達譜芯片的優(yōu)勢。基因表達譜芯片可以平行檢測眾多基因的表達情況,有助于全面了解植物在特殊處理、環(huán)境因子影響、發(fā)育階段、病原菌侵染等條件下較為完整的基因表達情況。通過與樣本對照,分析與特定事件相關(guān)的基因,進而確定相應(yīng)基因的功能或多個基因間的協(xié)同作用[5]。而對于基因表達譜芯片的解讀是這些研究的關(guān)鍵所在。

圖2 JxoI vs清水差異基因富集圖

基因芯片數(shù)據(jù)分析是解讀基因芯片數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。目前,可以分析基因表達量變化情況、代謝途徑變化情況,并且進行GO(Gene Ontology)分析的數(shù)據(jù)庫有很多,如博奧生物公司采用的MAS(molecule annotation system)系統(tǒng),GenMAPP分析軟件等。但這些分析工具有著明顯的不足之處,如MAS系統(tǒng)目前只能提供代謝途徑的網(wǎng)狀圖,而無法顯示代謝途徑中基因表達量的變化情況;GenMAPP目前提供的數(shù)據(jù)庫多是哺乳動物的數(shù)據(jù)庫,明顯缺少植物物種,適用于哺乳動物的研究。而Plant MetGenMAP數(shù)據(jù)庫適用于擬南芥、水稻、番茄基因芯片的分析,并且可以將基因表達量的變化情況與代謝途徑的改變情況結(jié)合在一起進行分析,結(jié)果簡潔直觀,為進一步研究基因功能和代謝途徑提供了方便。

本文利用A ffymetrix全基因組芯片測試結(jié)果,通過Plant MetGenMAP數(shù)據(jù)庫,初步分析了水稻受白葉枯病菌JxoI、非寄主菌Xv5侵染后基因表達的變化以及代謝途徑的改變情況,分析結(jié)果直觀、清晰明了,這為進一步發(fā)掘水稻抗病基因、研究水稻抗病防衛(wèi)反應(yīng)信號通路、揭示水稻抗/感病分子機制奠定了基礎(chǔ)。同時,提供了一種利用Plant MetGen-MAP數(shù)據(jù)庫分析基因芯片數(shù)據(jù)的方法。

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