黃皮種子甲醇提取物對茶黃薊馬的生物活性

張瑞明, 趙冬香, 萬樹青

(1.農藥與化學生物學教育部重點實驗室,華南農業大學昆蟲毒理研究室,廣州 510642;2.中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所,儋州 571737)

茶黃薊馬(Scirtothrips dorsa lis Hood),又名茶黃硬薊馬、脊絲薊馬,屬纓翅目,薊馬科,是芒果樹和茶樹的主要害蟲,在我國海南、廣東、廣西、福建、云南等芒果種植區均有分布。常見為害對象還有香蕉、葡萄和花生等作物。在海南,芒果受茶黃薊馬的危害尤為嚴重[1]。該蟲成、若蟲為害芒果嫩葉、花穗及幼果,早期在葉背取食,隨著蟲口的增加,薊馬轉移到葉表面取食。以成蟲、若蟲銼吸芒果樹汁液,造成嫩葉、幼果表面組織銼傷呈木栓化,葉片變色,嚴重影響芒果嫩葉和幼果的生長發育[2]。近年來,隨著海南省農業產業結構的改變,熱帶地區的海南芒果種植面積大幅度增加,茶黃薊馬的為害呈上升趨勢,如不及時采取有效的防治措施,將導致芒果嚴重減產,甚至失收[1]。目前,對芒果上茶黃薊馬的防治主要依賴化學方法,但化學農藥的過度頻繁使用無疑會加劇薊馬抗藥性產生,殺傷大量天敵,破壞生態平衡。因此,尋找高效、安全、易降解的新型殺薊馬藥劑顯得尤為緊迫。

黃皮[C lausena lansium(Lour.)Skeels]屬蕓香科黃皮屬(Clausena)植物,別名黃批、黃彈、黃皮子、黃彈子、黃檀子、黃壇子等[3],為原產于我國熱帶以及亞熱帶地區的一種特產果樹,在我國至少已有1 500年的栽培歷史。黃皮具有很高的藥用價值,其果、葉、根、種子均能入藥,含有香豆素、生物堿等活性成分[4]。目前,有關黃皮在抑菌、除草和殺蟲方面的報道很多。劉序銘等[5]報道,黃皮植株甲醇提取物對香蕉炭疽病菌和辣椒炭疽病菌等有一定的抑制活性。其中黃皮果核甲醇提取物對香蕉炭疽病菌菌絲生長的抑制率達到88.83%。盧海博等[6]報道,黃皮果核提取物在8mg/ML的處理濃度下,經紫外光(波長365 nm)照射2 h后,對稗草的根、莖、鮮重的抑制率分別為 87.84%、60.38%、18.40%,非光照處理為 77.99%、45.71%、14.44%;表現出了一定的光活化除草活性。萬樹青等[7]報道黃皮種子甲醇和石油醚提取物對蘿卜蚜具有很高的殺蟲活性。但對茶黃薊馬的活性研究還未見報道。本文以茶黃薊馬為研究對象,從觸殺和驅避作用兩方面研究黃皮種子提取物對茶黃薊馬的生物活性,并對殺薊馬的活性物質進行初步分離,為開發出經濟、安全、有效的植物源殺薊馬劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試蟲

黃皮種子,購于廣州市清平中藥材市場。

茶黃薊馬若蟲,采自中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所溫室大棚內芒果的嫩葉上。

對照藥劑為70%吡蟲啉水分散粒劑,由拜耳作物科學公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃皮種子粗提取方法

將購買的黃皮種子干品,置于電熱恒溫鼓風干燥箱中50℃烘干,粉碎機粉碎,過60～80目篩。所得黃皮種子干粉用密封袋密封遮光處保存備用。

稱取一定量的黃皮種子干粉,加入5倍體積的甲醇進行浸提,置于避光陰涼處,浸提每次持續72 h以上,期間數次搖動,浸提3次,將提取液合并,抽濾,經旋轉蒸發儀減壓濃縮至干,得黃皮種子甲醇粗提物,置于4℃冰箱保存備用。

1.2.2 活性成分的初步分離

采用液-液分配萃取法,稱取10 g黃皮核粗提物,用少量的甲醇溶解后,加入400 ML蒸餾水,轉入1 000 ML的分液漏斗中,用石油醚300 ML/次萃取3次。再用乙酸乙酯300 ML/次萃取3次,接著用正丁醇300ML/次萃取3次,最后得到的為水相萃取物,將各部分萃取液濃縮至干,4℃冰箱中保存備用。

1.2.3 生物活性測定方法

1.2.3.1 驅避活性測定

將黃皮種子甲醇提取物樣品用丙酮配制成2.5、5、10、20 g/L 4個濃度梯度的稀釋液,備用。參考周瓊[8]和張方平[9]的方法：將鮮嫩的芒果葉片帶葉脈剪成直徑為30mm的小圓碟,并保證葉脈兩側的葉面對稱一致,然后以葉脈為界,用干凈的毛筆在葉片一側的正反兩面用試液涂布均勻,另一側用丙酮處理作為對照,待葉片晾干,將葉片葉面朝上置于墊有濕棉花的培養皿內,用大小均勻規則的濕棉條沿葉片邊緣圍住葉片防止薊馬逃逸。然后將大小一致、健康的薊馬用毛筆輕輕挑在葉片上,每側15頭,共30頭。用保鮮膜封住培養皿,用昆蟲針在保鮮膜上扎若干個通氣孔。每個濃度梯度為一個處理,每個處理重復4次。將培養皿置于溫度為(25±0.5)℃、相對濕度為75%±3%、光周期為L∥D=12 h∥12 h的人工氣候箱中,于12 h和24 h檢查處理和對照葉片兩側的薊馬數(葉脈上的薊馬不計算在內),并計算驅避率。計算公式如下：

1.2.3.2 觸殺活性測定

采用浸葉法[10]：將黃皮種子甲醇提取物用少量的甲醇(低于1%)溶解,滴加少量的吐溫-80乳化,加無離子水配制成5、10、20、40、60 g/L 共5個濃度梯度的藥液,并將對照藥劑吡蟲啉配制成0.017 5、0.035 、0.07、0.14、0.28 g/L 5 個濃度梯度的藥液。取新鮮完整大小一致的芒果小圓碟葉片(直徑約為30mm)浸入藥液中5 s,取出葉片用吸水紙吸去多余藥液,放入潔凈的培養皿中,培養皿內鋪濾紙,滴清水保濕。每片葉用小毛筆輕輕移入試蟲20頭,每個處理3次重復,以含有少量吐溫-80的蒸餾水作對照。最后用保鮮膜封好培養皿,并用針在保鮮膜上扎若干個通氣孔。將培養皿置于溫度為(25±0.5)℃、相對濕度為75%±3%、光周期為L ∥D=12 h∥12 h的人工氣候箱中,于12 h和24 h檢查試蟲的死亡情況(死亡標準：以試蟲不能正常活動或者輕輕觸動蟲體無任何反應視為死亡[11]),并計算死亡率與校正死亡率。計算公式如下：

1.2.4 數據處理方法

死亡率采用Duncan’s新復極差檢驗法(DMRT法)進行方差分析,用Finney幾率分析法求出毒力回歸式,并對其進行卡方適合性檢驗,求出LC50及其95%置信限。所有數據采用Microsoft Excel 2003與DPS v7.05軟件處理。

2 結果與分析

2.1 黃皮種子甲醇提取物對茶黃薊馬的驅避活性

黃皮種子甲醇提取物對茶黃薊馬的驅避作用結果見圖1。從圖1可以看出,黃皮種子甲醇提取物對茶黃薊馬具有很好的驅避活性,在2.5 g/L濃度時,對茶黃薊馬12 h和24 h的驅避率分別達到62.07%和63.64%;而在20 g/L濃度時,對茶黃薊馬12 h和24 h的驅避率分別高達92.86%和89.91%。同時,圖1顯示在試驗階梯濃度下黃皮種子甲醇提取物對茶黃薊馬12 h和24 h的驅避率,隨著濃度的增加而呈上升趨勢。另外,在相同處理濃度下,不同處理時間的驅避效果有所不同,整體分析,12 h時的驅避效果要強于24 h時。

圖1 黃皮種子甲醇提取物對茶黃薊馬的驅避作用

2.2 黃皮種子甲醇提取物對茶黃薊馬的觸殺活性

黃皮種子甲醇提取物對茶黃薊馬的觸殺作用結果見表1。從表1可知,黃皮種子甲醇提取物對茶黃薊馬具有一定的觸殺活性,在處理后12 h和24 h對茶黃薊馬的致死中濃度(LC50)分別為16.60 g/L和12.85 g/L;而對照藥劑吡蟲啉則顯示出其很好的毒殺效果,在處理后12 h和24 h對茶黃薊馬的致死中濃度(LC50)分別為0.045 g/L和0.027 g/L。

表1 黃皮種子甲醇提取物處理12 h與24 h后對茶黃薊馬的觸殺效果

2.3 黃皮種子各萃取相對茶黃薊馬的觸殺活性

將黃皮種子甲醇粗提物進行液-液萃取,分別得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水相萃取物,并將其分別配制成5 g/L的濃度,采用浸葉法測定上述幾種萃取物對茶黃薊馬的觸殺活性,結果見表2。從表2可以看出,黃皮種子甲醇提取物不同溶劑萃取物對茶黃薊馬的觸殺活性具有明顯的差異。在相同處理濃度下,石油醚萃取物的觸殺活性最強,對茶黃薊馬24 h的校正死亡率為49%。而其他三相萃取物對茶黃薊馬的觸殺活性則很差。

表2 黃皮種子甲醇提取物的不同溶劑萃取物對茶黃薊馬24 h的殺蟲活性1)

3 討論

萬樹青等[7]在研究幾種植物提取物對蘿卜蚜的光活化殺蟲活性時,發現黃皮種子甲醇提取物和石油醚提取物對蘿卜蚜具有一定的殺滅作用。其中,當黃皮種子甲醇提取物濃度在1～5 mg/ML的范圍內時,蘿卜蚜的死亡率為60%～90%。馬伏寧等[12]研究發現黃皮種子甲醇提取物對松材線蟲(Bursaphelenchus xy lophilus)具有很高的毒殺活性,在1mg/ML濃度下處理72 h的校正死亡率為100%。這些研究表明,黃皮種子中可能含有對多種農業害蟲有效的活性物質,具有很大的開發潛力。而且黃皮的整個果實(包括果皮、果肉和種子)長期被作為一種水果和中藥材使用,從黃皮種子中提取的殺蟲化合物對人類和環境相對安全。

本試驗研究結果表明：黃皮種子甲醇提取物對茶黃薊馬具有很好的驅避作用和一定的觸殺活性,且隨著處理濃度的升高而增強。該結果再次顯示了黃皮種子代謝產物的殺蟲廣譜性和多種殺蟲作用方式。在不同溶劑的萃取物中,石油醚相萃取物對茶黃薊馬具有明顯的觸殺活性,而其他三相的觸殺活性則很差,表明黃皮種子中的殺薊馬活性物質主要存在于石油醚相,這為進一步從黃皮種子中分離殺薊馬活性物質提供了科學依據。總之,要從黃皮種子中開發出殺薊馬劑,在活性成分的分離純化和殺薊馬活性化合物鑒定以及作用機理、田間試驗等方面還有待深入研究。

[1]陳澤坦.吡蟲啉等幾種殺蟲劑防治芒果茶黃薊馬試驗[J].農藥,2003,42(1)：24-25.

[2]陳澤坦.我國芒果樹薊馬種類記述[J].植物保護,2004,30(4)：88-89.

[3]黃雪松,羅麗君.黃皮果、黃皮核中黃皮酰胺的測定[J].食品工業科技,2006,27(6)：172-173.

[4]閆少羽,崔承彬,姚新生.黃皮屬植物生物堿的研究進展[J].中國藥物化學雜志,2002,12(3)：179-186.

[5]劉序銘,馬伏寧,萬樹青.黃皮甲醇提取物的抑真菌作用[J].植物保護,2008,34(2)：64-66.

[6]盧海博,萬樹青,周麗興.黃皮果核有機溶劑浸提物對稗草光活化生長抑制活性[J].雜草科學,2005(2)：11-13.

[7]萬樹青,鄭大睿.幾種植物提取物對蘿卜蚜的光活化殺蟲活性[J].植物保護,2005,31(6)：55-57.

[8]周瓊,梁廣文,曾玲,等.多種植物乙醇提取物對桃蚜和蘿卜蚜試驗種群的控制作用[J].中國農業科學,2002,35(11)：1356-1360.

[9]張方平,劉紅芳,羅永強,等.25種熱帶植物乙醇提取物對比哈小爪螨驅避作用[J].植物保護,2006,32(4)：57-60.

[10]王偉,榮曉東,胡學難,等.幾種殺蟲劑對榕管薊馬的室內毒力測定[J].廣東農業科學,2009,(5)：112-113.

[11]陳年春.農藥生物測定技術[M].北京：北京農業大學出版社,1991.

[12]馬伏寧,萬樹青,劉序銘,等.黃皮種子中殺松材線蟲成分分離及活性測定[J].華南農業大學學報,2009,30(1)：23-26.