寧波檢驗檢疫局多次截獲非洲傘滑刃組線蟲

王江嶺, 顧建鋒

(寧波出入境檢驗檢疫局技術中心,寧波 315012)

近年來,隨著國際木材及木質包裝貿易的發展及國內的木材調運等,松樹萎蔫病的病原—松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)不斷在世界各國傳播和擴散。松材線蟲起源于美國,逐漸擴散到加拿大、墨西哥、日本、中國、韓國。1998年,葡萄牙海岸松上發現松材線蟲[1]后,葡萄牙(包括歐盟其他國家)立即展開調查,并制訂了根除計劃。但歐洲其他國家仍面臨著較大的威脅。2009年7月在南京舉行的國際松萎蔫病研討會上,葡萄牙Evora大學的Mota教授稱與葡萄牙接壤的西班牙某地已發現松材線蟲[2]。

在進境木質包裝檢測過程中,寧波出入境檢驗檢疫局植檢實驗室曾多次截獲非洲傘滑刃組線蟲。其中2006年5月從來自南非的木質包裝中截獲非洲傘滑刃線蟲(B.africanus);2006年10月、2009年4月分別從來自日本和巴西的木質包裝中截獲伯氏傘滑刃線蟲(B.burgermeisteri);2006年5月、2007年2月、2009年2月分別從來自印度尼西亞、印度尼西亞和巴西的木質包裝中截獲歐斐切傘滑刃線蟲(B.obeche)。現將截獲的非洲傘滑刃組線蟲報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

選取有藍變或蟲蛀特征的木質包裝用鋸子截成小段,編號后用塑料袋密封,帶回實驗室。如無癥狀則隨機取樣。

1.2 線蟲分離與形態鑒定

1.2.1 線蟲分離

采用改良漏斗法進行線蟲分離。將木樣劈成長100 mm、寬10 mm左右的薄片,置于漏斗中,加入適量水(以淹沒薄片為宜),25℃恒溫培養24 h后,用表面皿接取5～10 mL線蟲分離液,鏡檢。

1.2.2 形態鑒定與測量

用Zeiss Axioskop 40顯微鏡和Leica DFC 320數碼相機對線蟲的整體形態和內部特征進行觀察、攝影,并用De Man公式法進行形態特征測計。根據形態特征和測計結果,結合相關文獻,對該線蟲種類進行鑒定。

1.3 ITS-RFLP鑒定

1.3.1 線蟲DNA的提取

將線蟲放入ddH2O清洗,挑取單條線蟲放入200 μ L PCR 管 中[含 8 μ L ddH2O 和 1 μ L 10 ×PCR Buffer(Mg2+free)],85℃加熱5 min,-70℃放置30 min,85℃加熱2 min,向PCR管中加入1 μ L 1 000 μ g/mL 蛋白酶 K,56 ℃加熱 2 h,95 ℃加熱10 min,13 000 r/min離心PCR管1 min,得到DNA粗提液,-20℃保存備用。

1.3.2 PCR擴增

PCR 擴增采用50 μ L 反應體系 ：ddH2O 19.4 μ L,10 ×PCR Buffer(Mg2+free)5 μ L,25 mmol/L MgCl2 5 μ L,0.1 mmol/L dNTP 4 μ L,10 μ mol/L 上游引物 F 194[3](5′-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3′)3 μ L,10 μ mol/L下游引物 5 368 r[4](5′-T TTCACTCGCCGT TACTAAGG-3′)3 μ L,5 U/μ L Taq 酶 0.6 μ L,模板 DNA 10 μ L 。

擴增程序為：94℃4 min;94℃40 s,52℃1 min,72℃1.5 min,36個循環;72℃8 min。

1.3.3 RFLP分析

取上述 PCR 擴 增產物 8 μ L加 入 0.5 μ L ddH2O,并分別用 0.5 μ L的限制性內切酶Rsa I、Hae III、Msp I、Hinf I、Alu I于 37 ℃酶切 3 h,酶切后的DNA用加了EB的1.5%瓊脂糖凝膠電泳(5 V/cm,50 min),紫外檢測儀上觀察記錄結果并拍照,獲得線蟲的ITS-RFLP指紋圖譜(圖2)。

2 結果與分析

2.1 分類地位

非洲傘滑刃組線蟲隸屬滑刃目(Aphelenchida),滑刃總科(Aphelenchoidoidea),寄生滑刃科(Parasitaphelenchidae),傘滑刃屬(Bursaphelenchus)。

2.2 測量值

具體測量值如表1所示。

表1 非洲傘滑刃組線蟲測量值表μ m

續表1 μ m

圖1 非洲傘滑刃組顯微照片

2.3 形態描述

非洲傘滑刃組線蟲的主要鑒定特征是：側線4條;尾乳突7個(第3對和第4對靠近并位于交合傘起始處,第3對略位于第4對前并更靠近腹面);交合刺較直,中部有橫紋,冠狀體愈合(基頂和喙突不明顯),遠端無盤狀突,后陰子宮囊約占肛陰距1/2[5]。非洲傘滑刃組目前已知種類包括：非洲傘滑刃線蟲(B.af ricanus)、伯氏傘滑刃線蟲(B.burgermeisteri)、歐斐切傘滑刃線蟲(B.obeche)。

2.3.1 非洲傘滑刃線蟲

雌蟲：蟲體幾乎直,側線4條。唇縊縮明顯。中食道球卵形至梨形,瓣門位于中部。食道腺背覆蓋腸,長約4倍體寬。排泄孔位于中食道球對應處。卵巢長,占體長的3/4,卵母細胞多行排列,后漸成單行排列。陰門位于蟲體的77%處,明顯向內凹陷,形成顯著的陰門蓋。后陰子宮囊為肛陰距的2/3,偶爾可見精子。尾圓錐形,直,長約3～4倍肛門處體寬,末端圓。

雄蟲：蟲體前部與雌蟲相似,尾部呈鉤狀。精巢占蟲體的1/2至3/4,精母細胞多行漸至單行排列。肛門唇微突出。交合刺長約 21.7 μ m,略腹彎,基頂和喙突不明顯,中部有橫紋,遠端無盤狀突。交合傘顯著,長約15 μ m,邊緣有 3～4個突起,有時不規則。尾乳突7個。

2.3.2 伯氏傘滑刃線蟲

雌蟲：蟲體略腹彎,側線4條。縊縮明顯。中食道球圓形、卵形或梨形,瓣門位于中部。食道腺背覆蓋腸,長約4倍體寬。排泄孔緊鄰中食道球或位于中食道球后0.5倍體寬處。卵巢長,占體長的3/4,卵母細胞多行排列,后漸成單行排列。陰門位于蟲體的77%處,有顯著的陰門蓋。后陰子宮囊為肛陰距的60%～70%,偶爾可見精子。尾在肛門后明顯變細,圓錐形,明顯向腹面彎曲,長約 4～5倍肛門處體寬,末端圓。

雄蟲：蟲體前部與雌蟲相似,尾部呈鉤狀。精巢占蟲體的1/2～3/4,精母細胞多行排列。肛門唇微突出。交合刺長約 27.4 μ m,較直,但遠端明顯彎曲,呈“J”形。基頂和喙突不明顯,中部有橫紋,遠端無盤狀突。交合傘顯著,長約 15 μ m,鏟形或不規則形。尾乳突7個。

2.3.3 歐斐切傘滑刃線蟲

雌蟲：蟲體略向腹面彎曲,側線4條。唇縊縮明顯。中食道球卵形至梨形,瓣門位于中部。食道腺背覆蓋腸,長約3.5倍體寬。排泄孔位于中食道球對應處。卵巢長,占體長的2/3～3/4,卵母細胞多行排列。陰門位于蟲體的75%處,陰門蓋顯著。后陰子宮囊為肛陰距的2/3,偶爾可見精子。肛門后蟲體明顯變細,尾圓錐形,向腹面彎成鉤狀,長約4～5倍肛門處體寬,末端圓。

雄蟲：蟲體前部與雌蟲相似,尾部呈鉤狀。精巢占蟲體的3/4,精母細胞多行排列。肛門唇明顯突出 。交合刺長約23.1 μ m,遠端明顯腹彎 ,呈“J”形,中部有橫紋,基頂不明顯,喙突短小,末端銳尖或鈍尖,遠端無盤狀突。交合傘顯著,長約 13～14 μ m,卵圓形,有時不規則。

2.4 主要鑒別特征及區別

非洲傘滑刃線蟲：側線4條;交合刺較直,長約21.7 μ m,基頂和喙突不明顯;雌蟲陰門蓋顯著,尾較直,末端圓。

伯氏傘滑刃線蟲：側線 4條;交合刺長約27.4 μ m,較直,但遠端腹彎呈“J”形,基頂和喙突不明顯;雌蟲陰門蓋顯著,尾腹彎,末端圓。

歐斐切傘滑刃線蟲：蟲體細長,側線4條;交合刺“J”形,中部有橫紋,冠狀體幾乎愈合,長約23.1 μ m;雌蟲陰門蓋顯著,尾腹彎成鉤狀,末端圓。

非洲傘滑刃線蟲區別于另外2種線蟲在于：交合刺較直、微腹彎,雌蟲尾部較直。歐斐切傘滑刃線蟲與伯氏傘滑刃線蟲十分近似,其雄蟲交合刺都呈“J”形。區別是前者雌蟲尾腹彎更明顯,肛門后更明顯變細,且末端更寬圓;前者排泄孔位于中食道球對應處,而后者一般位于中食道球后;后者交合刺更長,平均達27.4 μ m,且后者交合刺喙突更銳尖。

2.5 ITS-RFLP圖譜

非洲傘滑刃組線蟲ITS序列大小分別為：非洲傘滑刃線蟲813 bp、伯氏傘滑刃線蟲853 bp、歐斐切傘滑刃線蟲814 bp。將獲得的非洲傘滑刃組線蟲的ITS-RFLP圖譜(圖2)進行比較,限制性內切酶RsaⅠ、HaeⅢ所切出的片段基本一致;限制性內切酶MspⅠ 、HinfⅠ、AluⅠ所切出的片段有所不同,具體酶切片段大小見表2。

圖2 非洲傘滑刃組線蟲ITS-RFLP圖譜的比較

表2 非洲傘滑刃組線蟲ITS-RFLP酶切片段大小[8]

3 討論

上述3種非洲傘滑刃組線蟲都是寧波口岸從南非、巴西、印尼和日本等國的白梧桐(Triplochiton scleroxylon)、輻射松(Pinus radiata)和其他松木(Pinus sp.)中截獲的。由于木質包裝的重復運輸和使用,其真正來源尚無法確定。

Braasch[5]等結合形態學和分子生物學特征,認為非洲傘滑刃組線蟲與松材線蟲組線蟲十分接近。由于松材線蟲危害極大,其近似種線蟲的致病性也值得高度重視。目前尚未開展非洲傘滑刃組線蟲的致病性研究,并且我國還沒有該組線蟲發生的報道,因此,要加強對進境木質包裝的檢疫,嚴防其傳入我國。

通過對非洲傘滑刃組線蟲的ITS-RFLP圖譜的比較,作者發現ITS-RFLP方法結果穩定、清晰,可重復性強,是有效而可靠的傘滑刃屬線蟲種類鑒定輔助手段[9]。

[1]Mota M,Braasch H,Bravo M A,et al.First report of Bursaphelenchus xy lophilus in Portugal and in Europe[J].Nematology,1999,1(7-8)：727-734.

[2]Vieira P,M ota M.Progress in research on the pinewood nematode(Bursaphelenchus xy lophilus),2006-2009[C]∥Nanjing Forestry University.International Symposium on Pine Wilt Disease Program and Abstracts.Nanjing：2009：20.

[3]Ferris V R,Ferris J M,Faghihi J.Variation in spacer ribosomal DNA in some cyst-fo rming species of plant parasitic nematodes[J].Fundamental and Applied Nematology,1993,16：177-184.

[4]Vrain T C.Restriction fragment length polymorphism separates species of the Xiphinema americanus group[J].Journal of Nematology,1993,25：361-364.

[5]Braasch H,Burgermeister W,Gu Jianfeng.Revised intra-generic grouping of Fuchs,1937(Nematoda：Aphelenchoididae)[J].Journal of Nematode Morphology and Systematics,2009,12(1)：65-88.

[6]Braasch H,Gu Jianfeng,Burgermeister W,et al.Bursaphelenchus af ricanus sp.n.(Nematoda：Parasitaphelenchida found in packaging wood exported from South Africa to Ningbo/China[J].J Nematode Morphol Sy st,2007,9(2)：71-81.

[7]Braasch H,Gu Jianfeng,Burgermeister W,et al.Bursaphelenchusburgermeisteri sp.n.(Nematoda：Parasitaphelenchidae)in packaging wood from Japan-a second species of the‘af ricanus'group[J].J Nematode Morphol Syst,2007,10(1)：39-48.

[8]Gu Jianfeng,Braasch H,Zhen Wei,et al.Bursaphelenchus obeche sp.n.(Nematoda：Parasitaphelenchidae)found in packaging wood exported from Indonesia to Ningbo,China[J].J Nematode Morphol Syst,2008,10(2)：165-175.

[9]Burgermeister W,Braasch H,Metge K,et al.ITS-RFLP analysis,an efficient tool for differentiation of Bursaphelenchus species[J].Nematology,2009,11(5)：649-668.