無機化合物對南方根結線蟲作用方式的研究

白春明, 段玉璽*, 陳立杰, 劉軼飛, 于曉飛

(1.沈陽農業大學植物保護學院北方線蟲研究所,沈陽 110866; 2.沈陽農業大學園藝學院,沈陽 110866)

南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)是一種典型的土傳病害,也是當今防治困難的世界性難題。該病害已經蔓延至全球,每年僅對世界上重要的經濟作物造成的損失就高達數百億美元[1]。線蟲長期存活在土壤中,土中的化學物質及多種植物所需的營養(無機化合物)對南方根結線蟲2齡幼蟲(J2)的作用尚不清楚。目前有關秀麗小桿線蟲(Caenorhabditiselegans)環境脅迫尤其是重金屬毒性作用的研究比較多[2-3],因為秀麗小桿線蟲易于在實驗室培養,繁殖速度快而可大量獲得,從受精卵發育到成蟲僅需不到4 d時間,試驗周期短,已經成功應用于土壤與環境中毒物毒性評估與毒理學研究[4]。而南方根結線蟲試驗周期長,獲得大量蟲源比較困難,有關無機化合物對南方根結線蟲的致死作用及作用機理的研究少之又少。我們在前期工作中篩選出南方根結線蟲敏感的化合物 NH4HCO3、CuSO4?5H2O和FeCl3?6H2O,這些化合物在低濃度下就可使J2致死。其中硫酸銅是眾所周知的殺菌劑,碳酸氫銨可作為基肥或追肥,且有報道稱有望成為殺線劑[5]。因此,我們進一步研究了敏感化合物溶液在離體條件下對南方根結線蟲J2的致死作用,對其運動行為、個體發育的影響及在脅迫處理下對J2呼吸作用和體液滲漏的影響,初步了解3種無機化合物對南方根結線蟲J2的作用方式。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲

根結線蟲采自遼寧省沈陽市東陵區渾河站鄉前賽村日光溫室內黃瓜上。單卵囊用0.4%NaClO消毒后接種番茄感病品種‘L402'(接種土經180℃干熱滅菌,‘L402'由遼寧省農業科學院惠贈)上進行擴繁,培養溫度為25～28℃,接種30～45 d后,番茄根系上有大量卵囊出現,取出根系,用水輕輕沖洗,獲得雌蟲和2齡幼蟲(J2),經嚴格鑒定為南方根結線蟲(Meloidogyne incognita)。待擴繁2代后,從感病番茄根系上挑取新鮮卵囊,用0.4%NaClO消毒3 min,再用無菌水沖洗3次,置于培養皿中,于25℃恒溫箱中培養,每隔24 h換水1次,保證每次選用的J2新鮮、活力一致。

1.2 供試化合物

經前期試驗確定南方根結線蟲最為敏感的無機化合物為 NH4HCO3、CuSO4? 5H2O、FeCl3?6H2O[6],試驗均采用分析純試劑。

1.3 無機化合物不同時間處理對南方根結線蟲J2存活及致死時間的影響

在體式顯微鏡下挑取新鮮活躍的南方根結線蟲J230條,放入1.5 mL離心管中,內有配制好的無機化合物 NH4HCO3、CuSO4?5H2O、FeCl3?6H2O LC50和LC90的溶液,分別為0.03 mol/L和0.04 mol/L、0.000 4 mol/L和0.000 5 mol/L、0.000 7 mol/L和0.001 1 mol/L,每管溶液體積為1 mL。分別處理0.5、1、3、6、12 h和 24 h 后在體式解剖鏡下觀察,記錄存活數量。無菌水處理為對照,每處理重復3次。

線蟲校正死亡率=[(處理組線蟲死亡率-對照組線蟲死亡率)/(1-對照組線蟲死亡率)]×100%。結果應用Excel 2003和SPSS 13.0軟件進行分析,并計算各化合物 LC50和LC90濃度下J250%死亡時間和90%死亡時間。半數致死時間定義為死亡線蟲數占測試線蟲總數一半時的時間;90%死亡時間定義為死亡線蟲數占測試線蟲總數90%時的時間。

1.4 無機化合物對南方根結線蟲J2運動行為的影響

運動行為的測定主要參照T salik和Hobert的方法[7]。

將新鮮活躍的南方根結線蟲J2放入濃度分別為LC50和LC90的NH4HCO3、CuSO4?5H2O和FeCl3?6H2O溶液中,每1 mL藥液放入30條J2,分別處理0.5、1、3、6、12 h 和 24 h,在體式解剖鏡下觀察并記錄1 min內J2身體彎曲的次數。身體彎曲頻率：1次彎曲定義為線蟲相對于身體長軸方向上的1個波長的移動。同樣方法記錄1 min內頭部擺動次數和J2運動的次數。頭部擺動頻率：J2頭部從一側擺向另一側后,再擺動回來。基本運動能力：J2在1 min內向前、向后和向前運動時,方向上出現小于120°的轉角運動的次數。無菌水處理為對照,每處理記錄10條J2運動行為,試驗重復3次。

1.5 無機化合物對南方根結線蟲J2個體發育的影響

用無機化合物NH4HCO3、CuSO4?5H2O和FeCl3?6H2O處理J2后測量其體長、口針長度和透明尾長度的變化。體長指沿線蟲體軸縱向的長度。將新鮮活躍的南方根結線蟲J230條放入濃度分別為 LC50和 LC90的體積為 1 mL溶液中,分別處理3、6、12 h和24 h后,挑取J2放在載玻片上用Motic數碼生物顯微鏡照相系統觀察、攝像并保存圖片,測量體長,無菌水處理為對照,每處理記錄10條J2的數據,試驗重復 3次?？卺橀L度和透明尾長用NH4HCO3、CuSO4?5H2O 處理 24 h后測量(活躍的J2不宜攝像且脂肪粒多看不清口針長度及透明尾長)。

1.6 無機化合物對南方根結線蟲J2呼吸作用和體液滲漏的影響

無機化合物對南方根結線蟲J2的呼吸作用采用溶氧儀測定法,對其體液滲漏的影響采用電導率測定法。配制線蟲懸浮液,J2濃度為2×104條/mL,分別用 NH4HCO3、CuSO4?5H2O 和 FeCl3?6H2O 的 LC50濃度處理 J20.5、1、3、6、12 h 和 24 h,用溶解氧測定儀(JPSJ-605)測定各處理線蟲的呼吸強度,計算藥劑對J2呼吸的抑制作用。用電導率儀(DDSJ-308A)測定各處理J2懸浮液的電導率。以純水及藥劑原溶液為對照。每次處理重復3次。試驗在25℃水浴中進行。

線蟲實際吸氧量(mg/L)=相應對照原溶液溶解氧-線蟲懸浮液溶解氧;

線蟲懸浮液實際電導率(μ s/cm)=線蟲懸浮液電導率-相應對照溶液電導率。

2 結果與分析

2.1 無機化合物不同時間處理對南方根結線蟲J2存活及致死時間的影響

試驗結果表明,南方根結線蟲J2隨著處理時間的增加和濃度的升高致死率上升(圖1)。所有化合物處理6 h后J2死亡率急劇上升,其中CuSO4?5H2O對J2的致死效果比其他化合物高。以CuSO4?5H2O LC50濃度處理 24 h后致死率達 71.11%,LC90濃度處理24 h致死率高達96.67%。在LC90濃度下3種化合物50%致死時間不超過10.14 h、90%致死時間不超過22.66 h。南方根結線蟲J2對3種化合物敏感性依次為：CuSO4?5H2O＞NH4HCO3＞FeCl3?6H2O(表1)。

圖1 無機化合物脅迫對南方根結線蟲J2存活的影響

表1 無機化合物對南方根結線蟲J2致死時間的影響1)

2.2 無機化合物對南方根結線蟲J2運動行為的影響

試驗結果表明,3種無機化合物均隨著時間加長顯著減少了南方根結線蟲J2的運動行為,表現為J2身體彎曲頻率、頭部擺動頻率和運動頻率降低。所有藥劑處理均降低了J2身體彎曲頻率。3種化合物不同濃度處理6 h前無明顯規律,6 h后LC90濃度比LC50處理對J2身體彎曲頻率的抑制作用強。當 NH4HCO3和 CuSO4?5H2O分別以LC90濃度處理1 h時,J2身體彎曲頻率比對照顯著升高,之后開始迅速降低。除了FeCl3?6H2O外,NH4HCO3和CuSO4?5H2O在 LC90濃度下處理12 h以上時J2基本無身體彎曲的能力(圖2上)。硫酸銅LC90處理1 h時J2突然加快了頭部擺動頻率,隨后迅速降低。其他基本與身體彎曲頻率結果相似(圖2中)。對于運動能力的影響,NH4HCO3和CuSO4?5H2O分別處理1 h時LC90比 LC50運動能力提高,但沒有對照高?；衔锩{迫后,J2運動能力比身體彎曲頻率和頭部擺動頻率受到的影響程度高,尤其是CuSO4?5H2O處理24 h時運動能力為零(圖2下)。

2.3 無機化合物對南方根結線蟲J2個體發育的影響

南方根結線蟲J2的體長為346～ 463 μ m,口針長度 10～ 12 μ m,透明尾長度 6～ 13.5 μ m。本試驗結果表明,所有處理無論時間長短還是濃度高低J2體長與對照相比顯著(p＜0.05)縮短,同一種化合物高濃度比低濃度處理后體長短。CuSO4?5H2O在LC90除了3 h處理外均比其他化合物處理J2體長短(圖3)?；衔锩{迫下口針長度與對照相比顯著變長,并且超出了正?？卺橀L度范圍。NH4HCO3和CuSO4?5H2O在2種濃度處理下J2口針長度變化不同。NH4HCO3高濃度處理比低濃度處理下J2口針長,而CuSO4?5H2O高濃度下比低濃度短。同樣,化合物脅迫下透明尾長度比對照顯著變長,但仍在正常透明尾長度范圍內,且同一種化合物高濃度處理比低濃度處理透明尾長度變長(表 2)。

表2 無機化合物處理南方根結線蟲J2 24 h后口針和透明尾長度變化1)

2.4 無機化合物對南方根結線蟲J2呼吸作用和體液滲漏的影響

無機化合物對南方根結線蟲J2呼吸有強烈的抑制作用。從圖4可以看出,3種無機化合物處理下線蟲的吸氧量比對照溶液中低,說明脅迫下南方根結線蟲J2吸氧率低,呼吸作用受到了抑制。當處理12 h以上呼吸作用停止。

圖4 無機化合物對南方根結線蟲J2呼吸作用的影響

無機化合物處理南方根結線蟲J2后,線蟲懸浮液的電導率均比對照增加。從圖5可以看出3種化合物處理線蟲液的電導率變化有所不同。

圖5 無機化合物對南方根結線蟲J2體液滲漏的影響

硫酸銅和氯化鐵脅迫0.5～3 h后線蟲懸浮液的電導率急劇上升,而后趨于平穩,電導率幾乎不變。而碳酸氫銨脅迫3 h后線蟲懸浮液電導率也處于上升趨勢,直至處理24 h,但比前兩個化合物脅迫下線蟲的電導率低。其中硫酸銅處理12 h以上,懸浮液的電導率最高為45.80 μ s/cm,比對照線蟲懸浮液的電導率增加了24.87%。

3 討論

2齡幼蟲是南方根結線蟲侵染寄主根系的唯一蟲態。因此,影響J2存活及活動能力的藥劑都能抑制其對植物根部的侵染,減少南方根結線蟲對植物根系的危害。本試驗中3種供試化合物在LC90濃度下使J250%致死時間不超過10.14 h,90%致死時間不超過22.66 h,離體條件下均對南方根結線蟲J2存活有強烈的抑制作用,并且可顯著降低南方根結線蟲J2的運動行為,導致J2身體彎曲頻率、頭部擺動頻率和運動能力降低、體長縮短、透明尾變長。對毒性機理研究的模式線蟲秀麗小桿線蟲報道較多。郝偉等[8]研究表明,重金屬鉛、鎘顯著降低矮小擬麗突線蟲(Acrobeloides nanus)平均體長,并抑制其生長發育及繁殖。王大勇等[2,9-11]研究表明,銅、鋇、鋁、鉻暴露可使秀麗小桿線蟲體長變短,運動行為發生嚴重缺陷,且這種表型與行為缺陷很大程度上可以從暴露當代傳遞到后代個體中。這些與作者的試驗結果相似,本試驗結果中透明尾變長可能是內含物的外滲透明區更加明顯導致。這些變化能否傳遞到后代需進一步研究。

線蟲是需氧生物,氧氣的含量不僅影響線蟲的存活,也影響線蟲的孵化。缺氧可以降低土壤中線蟲的數量,Stolzy等1960年研究表明,氧氣分壓為0時,南方根結線蟲的種群數量顯著減少[12]。大多數植物寄生線蟲體重為1～2 μ g,單個蟲體消耗氧氣為10-3μ L/h,這一數值很小,因此對于線蟲呼吸的研究比較困難,有關這方面的報道也非常少見。祁之秋等[13]研究表明二硫氰基甲烷對根結線蟲呼吸有抑制作用,藥劑處理的線蟲懸浮液電導率明顯高于對照,與本研究結果相似。線蟲的呼吸受到抑制且處理12 h以上時呼吸率為0,這可能是隨著線蟲死亡率的升高線蟲呼吸率極低,而溶解氧測定儀精確度不高,無法測出接近0的數據。線蟲體壁由表皮層和下皮層組成,是線蟲抵御外界不良環境條件和感受蟲體內部微細化學變化的重要結構。藥劑是作用于線蟲體壁,使內容物外泄導致電導率升高致線蟲死亡,還是通過口針或口腔進入腸道破壞了線蟲腸道結構,引起體液外滲導致線蟲死亡,有待進一步研究。

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