幾種常用殺蟲劑對瓜蚜的毒力和對乙酰膽堿酯酶的抑制作用

于永成, 刁青云, 李海平*

(1.內蒙古農業大學農學院,呼和浩特 010019;2.中國農業科學院蜜蜂研究所,北京 100093)

瓜蚜(Aphis gossypii Glover)又稱棉蚜,廣泛分布于全世界,是為害瓜類、豆類和棉花等多種農作物的主要害蟲之一,其中以棉花和瓜類受害最重[1]。瓜蚜是典型的r-害蟲,發育歷期短、生殖力高、世代重疊。在適宜的溫室環境條件下,瓜蚜大量繁殖,天敵等自然控制因素往往無法控制瓜蚜種群的增長,需要使用農藥才能控制其危害[2]。由于長期使用有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類殺蟲劑防治瓜蚜,導致瓜蚜產生抗藥性,藥劑的防效明顯下降[3-4]。大量研究證明,乙酰膽堿酯酶(AChE)不敏感性是昆蟲對有機磷類藥劑產生抗性的主要機制[5]。為了明確4種常用殺蟲劑氧樂果、辛硫磷、三唑磷、吡蟲啉對呼和浩特當地溫室中瓜蚜的毒力及有機磷殺蟲劑對瓜蚜AChE的抑制作用大小,作者采集呼和浩特市郊蔬菜基地黃瓜溫室內瓜蚜開展了本項研究,為田間更好地控制瓜蚜的危害提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 供試蚜蟲

瓜蚜采集于呼和浩特市郊蔬菜基地黃瓜溫室內,挑選個體大小、發育狀況相對一致的無翅蚜,一部分直接用來做生物測定,另一部分放入超低溫冰箱內冷凍,做酶的測定分析。

1.2 供試藥劑及儀器

碘化硫代乙酰膽堿(acetylthiocholineiodide,ATCh),(Sigma公司);5,5′-二硫雙硝基苯甲酸(5,5′-dithio-bis-2-nirorbenzoic acid,DTNB),(Fluka 公司);T ritonX-100,(Sigma公司);考馬斯亮藍 G-250,(Fluka公司);毒扁豆堿(Sigma公司);79.1%氧樂果原藥,90%辛硫磷原藥,80.5%三唑磷原藥,94%吡蟲啉原藥(山東濟南世幫農化公司提供);其他化學試劑均為國產分析純。

冷凍離心機(Hettich,universal 32R,Japan);紫外可見分光光度儀(T U-1810),北京普析通用儀器有限責任公司產品;電子天平(Sartorius 2004MP),Opton公司產品;恒溫水浴鍋,上海科技器材有限公司生產。

1.3 生物測定

參照Moores等的葉片藥膜法測定[6]。將農藥原藥稀釋成所需的6個濃度梯度,放入燒杯中。將室內種植的沒有接觸過藥劑的黃瓜葉片浸入藥液中,10 s后取出,在陰涼處晾干后把葉柄用脫脂棉保濕,放入培養皿中,用毛筆小心將采集的蚜蟲接到葉片上,每濃度至少接 30頭,重復 3次,放入25℃的恒溫培養箱內,24 h后檢查死亡數。以毛筆輕輕碰觸,蟲體不動計為死亡。數據用Polo軟件處理,計算出 LC50和斜率b。

1.4 AChE酶液制備

取瓜蚜40頭,加入1 mL預冷的0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH7.3,含0.1%TritionX-100),在冰浴條件下勻漿。勻漿液于4℃,10 000 g離心15 min后取上清液,抽濾后備用。

1.5 AChE比活力測定

采用高希武的方法[7],略有改動。取待測酶液0.1 mL與0.1 mL ATCH混合,30℃水浴鍋中保溫10 min后,加入1.8 mL DTNB顯色劑顯色并終止反應,然后于 412 nm下測定 A412nm值,計算AChE的比活力。比活力計算公式為：

AChE比活力=(ΔA412 nm/mg×V)/ε×L

其中,V為反應總體積(mL),ε為酶與底物反應的產物和DTNB絡合物的摩爾消光系數,值為13 600 L/(mol?cm),L為比色杯的光程,酶比活力單位為μ mol/(min?mg)。

1.6 農藥對瓜蚜AChE的體外抑制作用

以丙酮溶解農藥原藥制成母液,使用前用pH 7.3、0.1 mol/L的磷酸緩沖液將毒扁豆堿和氧樂果、三唑磷、辛硫磷原藥稀釋成不同濃度(濃度范圍為10-3～10-8mol/L)。反應時先在反應管中加入不同濃度的抑制劑和酶液混合,保溫10 min后,加入底物(ATCh),測其殘留的AChE活性。對照管以緩沖液代替抑制物。每個藥劑至少5個濃度,每個濃度3次重復。抑制率計算公式：

酶的抑制率=(對照A-處理A)/對照A×100%。

1.7 AChE時間抑制動力學曲線

將制備好的酶液分別與不同濃度的抑制劑混合后,在30℃的水浴鍋中保溫,每隔1 min將此混合物取出0.1 mL加入已經盛有0.1 mL底物的反應管中,反應15 min后加入1.8 mL顯色劑(DTNB)顯色并終止反應,測其A值。共檢測10個點,3次獨立重復。抑制劑分別為毒扁豆堿和其他3種有機磷類藥劑氧樂果、辛硫磷、三唑磷,前者終濃度為1×10-6mol/L,后者終濃度為1×10-5mol/L。

1.8 酶原蛋白含量測定

參照Bradford考馬斯亮藍G-250法[9],用牛血清白蛋白(BSA)測定蛋白質含量,繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 4種農藥對瓜蚜的室內毒殺效果

吡蟲啉是近幾年才開始在呼和浩特地區溫室使用的殺蟲劑之一。表1顯示了吡蟲啉和3種有機磷殺蟲劑對瓜蚜的室內毒力。測定結果表明,吡蟲啉對呼和浩特地區瓜蚜的致死中濃度僅為4.203 mg/L,三唑磷相對于吡蟲啉的相對毒力指數為10.30倍。氧樂果雖然長期使用,但其LC50值為21.698 mg/L,相對吡蟲啉的毒力指數為5.16倍。4種殺蟲劑對瓜蚜的毒力依次為：吡蟲啉＞氧樂果＞辛硫磷＞三唑磷。

表1 4種殺蟲劑對瓜蚜的室內毒力

2.2 3種有機磷殺蟲劑抑制瓜蚜AChE活性的劑量效應

圖1顯示了毒扁豆堿和3種有機磷殺蟲劑對瓜蚜體內AChE活性抑制的劑量效應。由圖可以看出,3種有機磷殺蟲劑對瓜蚜體內AChE活性抑制的趨勢一致,都隨著劑量的下降而抑制率急劇下降。相比較而言,毒扁豆堿對瓜蚜AChE活性抑制比較平緩。

圖1 毒扁豆堿和3種有機磷殺蟲劑抑制瓜蚜體內AChE活性的劑量效應

抑制中濃度(I50)通常表示酶對抑制劑的敏感度,I50值越大,說明酶對抑制劑越不敏感,反之越敏感。從三唑磷、辛硫磷和氧樂果對瓜蚜離體AChE的I50值比較可看出(表2),氧樂果對瓜蚜離體AChE的抑制中濃度最小,I50僅為9.6×10-6mol/L,瓜蚜AChE對氧樂果最敏感,其次為辛硫磷和三唑磷。

表2 毒扁豆堿和3種有機磷殺蟲劑對瓜蚜AChE離體抑制中濃度

2.3 毒扁豆堿和3種有機磷殺蟲劑抑制瓜蚜AChE的時間進程曲線

毒扁豆堿是AChE的專性抑制劑,圖2顯示了毒扁豆堿和3種有機磷殺蟲劑對瓜蚜AChE的時間抑制進程曲線。結果表明,毒扁豆堿對瓜蚜離體AChE的抑制速度最快,1 min就達到50%,之后隨著時間增加,抑制率逐漸增強。其他3種有機磷殺蟲劑對瓜蚜離體AChE的抑制速度相對較慢,1 min時抑制率僅為10%左右,但隨著時間的延長,抑制率增加很快,到10 min時,氧樂果和辛硫磷基本與毒扁豆堿抑制率相同。

圖2 毒扁豆堿和3種有機磷殺蟲劑在不同時間間隔對瓜蚜AChE活性的影響

3 討論

瓜蚜在全國各地都有分布,各地由于經濟水平發展的差異,用藥水平的差異也非常大,因此各地瓜蚜對常用藥劑的抗藥性情況也不盡相同。

氧樂果是有機磷殺蟲劑中使用時間較長的藥劑,由于其具有內吸性,常被用來防治蚜蟲、木虱、紅蜘蛛等刺吸式口器的害蟲。但關于瓜蚜對氧樂果的抗性報道卻很少。吳世昌等測定了上海地區常用殺蟲劑對瓜蚜的毒力[3],瓜蚜對氧樂果已經產生了中等程度的抗性,在上海地區需要限制氧樂果使用。而本試驗中,氧樂果對瓜蚜的LC50僅為21.70 mg/L,瓜蚜對氧樂果還比較敏感,可以和其他藥劑交替使用。

吡蟲啉是近幾年才開始使用的殺蟲劑之一,主要用來防治刺吸式口器的害蟲。但近幾年國內外已經有不同種類蚜蟲對吡蟲啉產生抗藥性的報道[10-13]。而關于瓜蚜對吡蟲啉的抗性情況至今還沒有報道。路虹等測定了吡蟲啉對瓜蚜的毒力[14],致死中濃度LC50為9.674 mg/L,本試驗中吡蟲啉對瓜蚜的致死中濃度LC50為4.20 mg/L,說明目前在呼和浩特地區,瓜蚜對吡蟲啉還處于敏感階段,可以作為防治選擇的藥劑之一。

乙酰膽堿酯酶是有機磷及氨基甲酸酯類殺蟲劑的主要作用靶標,乙酰膽堿酯酶被殺蟲劑抑制后,正常的神經傳導被阻斷,而神經傳導的阻斷必然會影響整個生理生化過程的失調與破壞,最終造成昆蟲的死亡[15]。試驗中3種有機磷殺蟲劑均能顯著抑制瓜蚜體內乙酰膽堿酯酶的活性。劉紅霞等研究了幾種抑制劑對花翅搖蚊體內乙酰膽堿酯酶的抑制[16],氧樂果對花翅搖蚊體內乙酰膽堿酯酶的抑制中濃度為9.42×10-6mol/L,本試驗中氧樂果對瓜蚜體內乙酰膽堿酯酶的抑制中濃度為 9.6×10-6mol/L,兩者的結果類似。王瑩等研究了辛硫磷和三唑磷對枸杞木虱乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用[17],其中對木虱成蟲乙酰膽堿酯酶活性的抑制中濃度三唑磷大于辛硫磷,與本試驗結果一致。試驗中3種有機磷殺蟲劑對瓜蚜乙酰膽堿酯酶活性抑制的強弱與生測結果一致。

因此呼和浩特地區在防治溫室瓜蚜時,要注意瓜蚜對吡蟲啉、氧樂果較敏感,但是也有產生抗藥性的風險。在田間防治時,建議和其他藥劑交替使用,同時也要控制用藥次數。提倡合理使用殺蟲劑,且要合理混用或交替、輪換用藥,以保證防治效果,延長藥劑使用壽命,使蚜蟲的抗性水平保持在較低的敏感狀態,延緩抗藥性的發展。

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