土壤放線菌的選擇性分離及其代謝產物抗菌活性評價*

譚悠久, 彭 祎, 黃永春

(農業部環境保護科研監測所,農業部/天津市產地環境與農產品安全重點開放實驗室,300191)

以放線菌為來源的抗生素研究一直備受關注,在放線菌代謝產物中發現的包括抗生素在內的大量新活性物質中約70%～80%是從鏈霉菌發現的[1-2]。雖然從鏈霉菌屬發現新的生物活性物質從未間斷過,但鏈霉菌屬外的放線菌也是生物活性物質的重要產生菌[3-4]。近年來從鏈霉菌屬外的小單孢菌屬[5-6]、諾卡氏菌屬[7-10]、小雙孢菌屬[11]、馬杜拉放線菌屬[12]、指孢囊菌屬[13]、鏈孢囊菌屬[14]、放線多孢菌屬[15]、游動單孢菌屬[16]、擬無枝菌酸菌屬[17]、北里孢屬[18]、Kibdelosporangium[19]等分離到多種生理活性物質,顯示了代謝產物多樣性的特點。

本文主要研究土壤樣品中放線菌的選擇性分離,以期分離到利用常規分離方法出菌率低的放線菌菌株,并對選擇性分離得到的放線菌代謝產物進行抗菌活性評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

采自安徽、重慶、江蘇、吉林、河北、湖北、山東、四川、天津、云南及德國萊比錫等地不同生態環境的45份土壤樣品。

1.1.2 指示菌

1.1.3 培養基

放線菌分離培養培養基(改良的HV培養基)：腐質酸 0.1%,K2HPO40.1%,NaCl 0.08%,Mg-SO40.05%,CaCO30.001%,復合維生素(維生素B1、核黃素 、煙酸 、維生素 B6、泛酸鈣 、肌醇、對氨基苯甲酸各0.000 05%,生物素0.000 025%),土壤浸提液10%,瓊脂2%。

放線菌斜面培養基：酵母膏 0.3%,蛋白胨0.5%,麥芽浸膏 0.3%,葡萄糖1%,瓊脂2%。

真菌培養基：土豆汁 20%,加葡萄糖2%,瓊脂2%。

細菌培養基：牛肉膏 0.3%,蛋白胨 1%,氯化鈉0.5%,瓊脂2%。

放線菌平板培養基：可溶性淀粉1.5%,酵母膏0.4%,K2HPO40.2%,MgSO40.05%,葡萄糖0.25%,蛋白胨 0.2%,玉米漿 1.2%,麥芽浸膏0.25%,復合維生素0.01%,瓊脂2%。

放線菌發酵培養基：可溶性淀粉1.5%,酵母膏0.4%,K2HPO40.2%,MgSO40.05%,葡萄糖0.25%,蛋白胨 0.2%,玉米漿 1.2%,麥芽浸膏0.25%,復合維生素0.001%。

1.1.4 抑制劑

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萘啶酮酸 20 μ g/mL,制霉菌素 50 μ g/mL 。

1.1.5 供試植物

日本天鷹椒(購自天津農科院)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集、預處理、菌株分離

從土壤表面采集土層,用速封袋裝好,帶回實驗室,迅速將土壤樣品風干,研磨成粉,用前100℃干熱處理60 min。稱取約1 g預處理土壤樣品,加入無菌試管,加10 mL滅菌水,充分振蕩,10倍系列稀釋,取200 μ L涂布平板,28℃倒置培養15～25 d,用接種針挑取單菌落于斜面培養基培養。

1.2.2 放線菌代謝產物抗菌活性平板初篩

從斜面挑取放線菌菌落,于培養皿內畫線,28℃倒置培養14 d;用直徑5 mm的打孔器打制帶菌落的瓊脂塊,依次將瓊脂塊等距接到混有指示菌的直徑為15 cm的培養皿中,每個培養皿接40個不同的放線菌菌株;25℃培養2～3 d,觀察抑菌情況,測量抑菌圈直徑。

1.2.3 放線菌抗菌活性復篩

挑選經初篩抑菌活性較強的菌株,從斜面刮取成熟孢子,接入發酵培養基中(250 mL三角瓶裝液量50 mL),200 r/min,28℃培養5 d,離心取上清液備抗菌活性檢測;抗菌活性檢測采用管碟法[20]。

1.2.4 對辣椒疫霉的保護作用

取4葉期辣椒苗(每盆30棵苗),均勻澆灌發酵液原液,48 h后將辣椒疫霉菌的孢子懸浮液(孢子濃度106個/mL)灌根,每處理4次重復,以清水為對照,7 d后調查病情和防治效果,試驗重復2次。數據進行5%水平上的差異顯著性分析。

2 結果

2.1 放線菌的選擇性分離

從45份土壤樣品中共選擇性地分離到570株放線菌菌株,平均每份土壤分離到約12.7個菌株,堆肥中菌株分出率最高,其次為旱地、礦渣,灰燼和海泥分出率較低。分離效果見表1。經鑒定,分離到的放線菌菌株分別屬于鏈霉菌屬、小單孢菌屬、諾卡氏菌屬、小雙孢菌屬、馬杜拉放線菌屬、放線多孢菌屬、游動放線菌,但仍以鏈霉菌屬菌株居多。

表1 不同土壤樣品分離效果

2.2 放線菌代謝產物抗菌活性初篩

對570個放線菌菌株進行了瓊脂塊初篩評價。結果顯示,212個菌株代謝產物顯示了抗真菌或抗細菌活性,占總菌株數量的37.2%,33個菌株代謝產物兼具抗真菌活性和抗細菌活性,占菌株數量的5.8%;77個菌株代謝產物對黑曲霉有抑制作用,占菌株總數的13.6%;57株菌代謝產物對棉花枯萎菌有抑制作用,占菌株總數的10.0%;55個菌株代謝產物對稻瘟病菌有抑制作用,占菌株總數的9.7%;137個菌株代謝產物對辣椒疫霉有抑制作用,占菌株總數的24.2%;59個菌株代謝產物對青枯菌有抑制作用,占菌株總數的10.4%。

2.3 放線菌抗菌活性復篩

經平板瓊脂塊初篩,挑選出12株對部分指示菌具有較強抑制作用或具有廣譜抗菌活性的菌株進行復篩,復篩結果見表2。有4個菌株(TJ211、TJ231、TJ234、TJ430)發酵液對所有指示菌具有抑制作用,但以TJ231、TJ430菌株抑制效果最明顯;1個菌株(TJ561)發酵液對所有指示真菌具有強烈的抑制效果,但無抑制細菌作用。

2.4 菌株發酵液對防治辣椒疫霉病的保護效果

將通過搖瓶復篩獲得的3株具有較強抗真菌活性的菌株搖瓶發酵,進行活體防效評價。結果見表3,菌株 TJ231、T J430、TJ561對防治辣椒疫霉病的保護效果分別為56.2%、87.2%、61.4%。

表2 放線菌抗菌復篩結果1)

表3 發酵液對防治辣椒疫霉病的保護效果1)

3 討論

有較多報道認為,土壤樣品的來源決定了分離放線菌的數量與種類。鏈霉菌廣泛分布于各種環境;小單孢菌也廣泛分布于各種環境[21],但以稻田、草地、湖底為主;小雙孢菌主要分布在植物體內,在紅樹林根圍土壤也有分布[22];諾卡氏菌土生、水生,在河流、湖底和海洋沉積物中均有分布[23]。鏈孢囊菌屬、游動單孢菌屬在森林土壤中有分布[24]。因此,為保證樣品來源的豐度,作者從不同地區的不同生態環境采集了土壤樣品。風干土壤樣品在100℃干熱處理60 min,可以除去多數不耐熱鏈霉菌,能有效分離鏈孢囊菌、小雙孢菌、小四孢菌、馬杜拉放線菌、小單孢菌、游動放線菌等稀有放線菌[25],因此為了減少常規鏈霉菌,提高稀有放線菌的分出率,本試驗采用了100℃干熱處理60 min的分離方法。采用含腐殖酸、維生素的HV培養基作為基礎培養基,可以提高放線雙孢菌、北里孢菌、小雙孢菌、擬諾卡氏菌、游動放線菌、Longispora等很多未知放線菌的分出率[26]。從分離效果比較,雖然仍以分離到鏈霉菌為主,但也分離到包括小單孢菌、諾卡氏菌、小雙孢菌屬、馬杜拉放線菌屬、放線多孢菌屬、游動放線菌等多種稀有放線菌。

通過平板瓊脂塊初篩,表明選擇性分離到的放線菌是產抗菌活性物質的重要類群。復篩結果顯示,多數菌株發酵液對病原菌的抑制效果基本與初篩結果相吻合。盆栽試驗表明,搖瓶篩選與盆栽試驗存在一定差異。菌株T J231、TJ561雖然在搖瓶篩選中對辣椒疫霉顯示了強烈的抑制效果,但在活體防效并不明顯。菌株TJ430則在搖瓶篩選與盆栽試驗中具有良好的抑制效果和防效,顯示了較好的開發應用前景,其代謝產物分析工作已經在實驗室逐步展開。

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