啟動子區E-box以及周圍CpG島的甲基化與基因節律性表達的關系

左曉虹 劉 姝 林慶玲 李 寧 陳 彪 蔡彥寧

(首都醫科大學宣武醫院神經生物學研究室，教育部神經變性病重點實驗室北京 100053)

mPer1(mPeriod 1)、mPer2(mPeriod 2)、mCry1(cryptochrome 1)和mDBP(D site of albumin promoter binding protein)等節律基因的節律性表達是通過其基因啟動子區域的 E-box和 BMAL1〔brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator(ARNT)-like〕/CLOCK異源二聚體的結合來調節，其結合在節律基因日波動表達的調節中起關鍵作用［1-4］。但是這些基因的E-box與BMAL1/CLOCK的結合方式有明顯不同。在經典節律器官——肝臟中，mPer1、mPer2的 E-box 全天持續穩定和 BMAL1/CLOCK 結合［3，5］，而mCry1和mDBP的E-box和BMAL1/CLOCK的結合在一天之中呈動態變化［2，4］，mCry1 E-box 的結合高峰出現在開燈后(hours after light onset，HALO)3～9 h，低點在 HALO 15 ～18 h［6］;mDBPE-box 的結合高峰出現在HALO 5～11 h，低點在HALO 17～23 h。影響基因和蛋白相互作用的因素很多，包括蛋白含量、NAD(P)/NAD(P)H濃度、蛋白磷酸化水平等，但在同一個細胞內，這些因素是相同的，因此我們推測影響E-box和異源二聚體結合差異的原因極可能是由于E-box及其周圍的序列差異造成的。

人們普遍認為MAP激酶磷酸化酶1(MAP kinase phosphatise 1，MKP1)是一種典型的時鐘控制基因(clock-controlled gene，CCG)，其啟動子區有一個功能節律性的E-box［7］。MKP1的轉錄水平在小鼠視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)呈現強節律性表達，而在肝臟呈現弱節律表達，在腎臟有持續穩定的表達［8］，因此可以推測組織特異性的E-box及其周圍的序列可能決定了MKP1的組織特異性表達。

由于在經典形式(如mPer1、mCry1、mDBP和mMKP1中)和非經典形式(如mPer2中)的E-box中常常包含DNA甲基化潛在靶點——CpG雙核苷酸，因此有研究推測E-box的甲基化極可能參與分子水平的節律性表達［9］。此外大多數E-box都位于CpG島中，附近其他CpG島序列的甲基化亦可能調節E-box的節律性功能活動。在腫瘤組織和細胞系中發現一些E-box和CpG島在發育過程中被甲基化［10-13］。本實驗組前期實驗［14］結果也表明mPer1的E-box3和E-box4發生明顯甲基化。

為更好地了解甲基化在E-box和BMAL1/CLOCK異源二聚體相互作用中是否起調節作用以及甲基化是否在MKP1的組織特異性表達中起決定作用，本研究將采用重硫酸鹽基因組測序法檢測mPer2、mCry1、mDBP和mMKP1啟動子區含E-box的CpG島的甲基化形式。結果表明甲基化與所有E-box與BMAL1/CLOCK異源二聚體的節律性結合無關，大部分含E-box的CpG島也與甲基化無關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性C57 BL/6J小鼠18只，8周齡，體質量18～20 g，由軍事醫學科學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號:SCXK-(軍)-2007-004。

1.2 主要試劑、藥物和器械

QIAamp DNA mini試劑盒(美國Qiagen公司)，Wizard DNA純化試劑盒(美國 Promega公司)，HS Taq(日本Takara公司)。

1.3 動物分組與實驗處理

小鼠按如下條件飼養2周:飲食、飲水自由，早8:00開燈、晚20:00關燈，12 h照明、黑暗循環。2周后采用數字表法隨機分6組，每組3只，從早9:00開始每隔4 h取1組動物的肝臟、腎臟。

1.4 E-box和CpG島的選擇

檢測以下基因E-box和旁側區域CpG島的甲基化位點:肝臟mPer2、mCry1、mDBP、mMKP1 以及腎臟mMKP1。具體選擇5個特定的E-box:mPer2非典型E-box［3］、mCry1 在-270 和-265 之間的 E-box［2］、mDBP2個內含子區域以及mMKP1啟動子區E-box［7］。

1.5 制備基因組DNA和重硫酸鹽處理

基因組DNA用QIAamp DNA mini試劑盒制備。在重硫酸鹽處理過程中所有胞嘧啶將轉變為尿嘧啶，而5'甲基化胞嘧啶保持不變。先將基因組DNA用0.3 mmol/L NaOH變性處理，再加入偏亞硫酸氫鈉(pH 5.0)和對苯二酚使終濃度分別為3.0 mmol/L和0.5 mmol/L。反應混合物上加礦物油，避光，于50℃孵育16 h。修飾后的DNA用Wizard DNA純化試劑盒純化后用0.3 mmol/L NaOH處理15 min，乙醇沉淀。

1.6 擴增、測序

經重硫酸鹽處理的DNA樣品用HS Taq擴增，選用4個基因CpG島的引物見表1。將相同基因同一時間點相同組織的3個DNA擴增產物混合，克隆到pGEMT載體，挑選10～15個克隆送北京諾賽基因生物公司測序。相同實驗重復3次。

1.7 結果分析

用網上軟件(MethPrimer)分析每個基因E-box和周圍CpG島的數目;通過對比所有測序數據，評估每個基因甲基化的狀態。

表1 用于重硫酸鹽處理后PCR的引物Tab.1 Oligonucleotide primer sequences used in bisulfite PCRs

2 結果

2.1 MethPrimer分析結果

每個基因的E-box及旁側序列見圖1A，用網上軟件(MethPrimer)分析E-box中的CpG島，選擇限制:100 bp，CpG島比率≥0.6。分析結果顯示以上5個 E-box均包含一個假定的CpG島，見圖1。

圖1 基因啟動子區擴增序列匯總Fig.1 Summary of promoter regions subject to bisulfite genomic sequencing

2.2 肝臟中 mCry1、mDBP、mPer2 E-box和周圍CpG島的甲基化狀態

重硫酸鹽處理基因組DNA測序用于檢測E-box和周圍CpG島的甲基化狀態。如表2所示，mCry1共檢測59個CpG島，E-box在第3個CpG島位點;mDBP有22個CpG島，包含2個E-box分別在第6個和19個CpG島位點;mPer2有54個CpG島，E-box在第10個CpG島位點。

表2 節律基因重硫酸鹽處理后PCR產物大小以及CpG島數目Tab.2 PCR products and number of CpG in every gene

圖2、3、4分別顯示肝臟中6個時間點mCry1、mDBP、mPer2 E-box的甲基化狀態，表明mCry1、mDBP、mPer2 E-box甲基化不明顯，而且包含E-box的CpG島也更大程度表現為非甲基化狀態。

圖2 肝臟6個時間點mCry1 E-box和周圍CpG島的甲基化狀態Fig.2 Examination of methylation status of E-box containing CpG islands in the promoter of mCry1

2.3 肝臟和腎臟中mMKP1 E-box和周圍CpG島的甲基化狀態

Cyber分析表明mMKP1的E-box為第22個CpG島，共有40個CpG島，如圖5所示，測序結果表明在肝臟和腎臟中E-box和周圍CpG島的甲基化無明顯差異。

圖3 肝臟6個時間點mDBP E-box和周圍CpG島的甲基化狀態Fig.3 Examination of methylation status of E-box containing CpG islands in the promoter of mDBP

圖4 肝臟6個時間點mPer2 E-box和周圍CpG島的甲基化狀態Fig.4 Examination of methylation status of E-box containing CpG islands in the promoter of mPer2

3 討論

圖5 肝臟和腎臟01HALO mMKP1 E-box和周圍CpG島的甲基化狀態Fig.5 Examination of methylation status of E-box containing CpG islands in the promoter of mMKP1

已有學者［2-5］利用定量染色質免疫沉淀-PCR的方法研究肝臟中BMAL1/CLOCK異源二聚體與mPer1、mPer2、mCry1和mDBP等節律基因的E-box之間的相互作用，這些結果表明BMAL1/CLOCK異源二聚體與不同節律基因的E-box之間的結合方式不同，它們與mPer1、mPer2的E-box 24 h內持續結合，而與mCry1、mDBP的結合呈現日節律變化，與mCry1的結合高峰在HALO 03～09 h，低點在HALO 15～18 h;與DBP的結合高峰在 HALO 05～11 h，低點在 HALO 17～23 h。我們推測mCry1、mDBP的E-box甲基化水平在24 h呈波動性波動，并且影響蛋白和DNA的相互作用;而mPer1、mPer2啟動子E-box的甲基化水平保持恒定。由于mPer1 E-box的甲基化狀況已有研究組［14］檢查過，此次研究主要檢測mPer2、mCry1 和mDBP啟動子E-box的甲基化水平。本研究的結果中所有E-box無明顯甲基化狀態，而且包含E-box的CpG島也更大程度表現為非甲基化狀態。這些結果證明在肝臟中DNA甲基化不會影響BMAL1/CLOCK異源二聚體與節律基因mPer2、mCry1和mDBP啟動子E-box之間的相互作用。不同啟動子與BMAL1/CLOCK異源二聚體結合方式的細微差別的潛在機制將有待于從其他角度進一步研究。

MKP1在SCN和肝臟中的表達是節律性的，但在腎臟中不具有節律性［7］。表明由分子時鐘機制控制的MKP1的表達有組織特異性。我們推測腎臟中MKP1啟動子的功能性E-box可能被甲基化并保持持續不與BMAL1/CLOCK異源二聚體結合。為檢驗這一假說的正確性，我們檢測肝臟和腎臟中MKP1在HALO 01 h的甲基化狀態。Cyber分析結果證實mMKP1的E-box為第22個CpG島，共有40個CpG島，測序結果表明在肝臟和腎臟中E-box和周圍CpG島甲基化狀態差異無統計學意義。這些結果證實DNA的甲基化不參與MKP1的組織特異性分子時鐘調控。

到目前為止，通過微矩陣分析已有數千個時鐘控制基因(clock control gene，CCG)被證實［15］，而這些CCG中只有一小部分在不同組織中有相同的表達模式，多數CCG因受到組織特異的分子時鐘機制的調控在不同組織中有特異性的表達模式，它們多通過E-box和BMAL1/CLOCK異源二聚體的節律性結合來調節基因的表達［16］。本研究組研究結果證實DNA甲基化在CCG的組織特異性調控中并不起決定性作用。

總之，本研究結果和我們的前期研究［14］結果證實節律基因的E-box默認處于非甲基化狀態，便于其能與BMAL1/CLOCK異源二聚體相結合。而節律基因組織特異性表達的具體機制有待于進一步研究。

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