α-突觸核蛋白在人腦膜瘤組織中的表達(dá)

吳 楊 蘇玉金 李 昕 劉光偉 李堯華 于 順*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053;2.首都醫(yī)科大學(xué)天壇醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所，北京 100050)

α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)由 140 個(gè)氨基酸組成，在中樞及外周神經(jīng)組織中含量豐富，主要存在于成年人腦組織神經(jīng)元的突觸前終末端，與突觸可塑性的形成有關(guān)［1］。α-syn在胚胎腦組織主要存在于神經(jīng)元的胞體中，隨著胚胎發(fā)育，逐漸分布到突觸前終末端［2-3］。以往的研究［4-5］表明，α-syn 可以促進(jìn) β-微管蛋白組裝成微管，并提高培養(yǎng)的MES23.5多巴胺神經(jīng)細(xì)胞增生速度。鑒于α-syn家族中的另一個(gè)成員 γ-突觸核蛋白(γ-synuclein，γ-syn)也具有促進(jìn) β-微管蛋白組裝成微管的作用［6］，并影響腫瘤細(xì)胞的增生、遷移和侵襲性［7］，推測(cè) α-syn也可能存在于腫瘤細(xì)胞中，并發(fā)揮與γ-syn類似的作用。本課題組利用免疫組織化學(xué)方法證明α-syn在人腦膜瘤組織中的表達(dá)，觀察其與β-微管蛋白之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 組織切片

人腦組織切片來自首都醫(yī)科大學(xué)天壇醫(yī)院神經(jīng)外科患者經(jīng)手術(shù)切除的腦組織，其中20例為腦膜瘤組織。5例為癲癇病人異常放電腦組織，作為對(duì)照腦組織。所有組織均制備成石蠟包埋切片。

1.1.2 主要試劑

兔抗人α-syn多克隆抗體、鼠抗人α-syn單克隆抗體 3D5 均由本室制備［8-9］;鼠抗人突觸素(synaptophysin，SYP)抗體(美國(guó)Santa cruz公司);鼠抗人β-微管蛋白單克隆抗體、生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG、生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、鏈霉親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG、TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(美國(guó)Vector Laboratory公司);其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色

將腦組織切片依次通過二甲苯、不同濃度乙醇和檸檬酸緩沖液進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)，3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液封閉，然后與不同抗人 α-syn的抗體(兔多克隆抗體 1∶10 000、3D5 1∶4 000)于4℃反應(yīng)過夜，與生物素標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG(1∶1 000)室溫反應(yīng)2 h，再與鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(1∶1 000)室溫反應(yīng)1 h，用含有DAB的顯色液顯色，在顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.2 免疫熒光雙重標(biāo)記

脫蠟和抗原修復(fù)腦組織切片，經(jīng)3%BSA封閉后，在4℃條件下與兔抗人α-syn多抗(1∶500)和鼠抗人β-微管蛋白單抗(1∶50)或鼠抗人 SYP單抗(1∶400)反應(yīng)過夜，再與FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶800)和TRITC明標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶800)室溫反應(yīng)2 h。熒光標(biāo)記結(jié)果用熒光共聚焦顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 α-syn在對(duì)照腦組織中的表達(dá)

在正常腦組織中，α-syn免疫活性物質(zhì)呈細(xì)小的顆粒狀，均勻分布于腦組織的神經(jīng)元之間，提示這種蛋白在神經(jīng)末梢存在(圖1)。免疫熒光雙重標(biāo)記證明，α-syn在神經(jīng)末梢與突觸特異蛋白突觸素共存。α-syn免疫活性物質(zhì)還見于神經(jīng)元的胞體和近端突起部位。α-syn在神經(jīng)元末梢與 β-微管蛋白共存(圖2)。

2.2 α-syn在腦膜瘤組織中的表達(dá)

在腦膜瘤組織，α-syn免疫陽(yáng)性細(xì)胞呈漩渦狀或巢狀分布。α-syn免疫活性物質(zhì)主要分布于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)與核膜。此外，α-syn也見于少數(shù)腫瘤細(xì)胞的胞核中。在不同腫瘤細(xì)胞團(tuán)中的α-syn免疫活性物質(zhì)的含量不同，有些細(xì)胞團(tuán)含量較高，而另一些則較低(圖3，4)。兩種不同抗體所顯示 α-syn的表達(dá)位置相同。

免疫熒光雙重標(biāo)記結(jié)果顯示，在腦膜瘤細(xì)胞中，α-syn和β-微管蛋白在胞質(zhì)均呈陽(yáng)性反應(yīng)，并且共存(圖5)，在腫瘤組織中β-微管蛋白表達(dá)量多，而在正常組織中表達(dá)量則較少。

圖1 抗人α-syn抗體顯示α-syn在對(duì)照腦組織中的分布Fig.1 Anatomical distribution of α-syn in control humen brain

圖2 免疫熒光雙重標(biāo)記顯示α-syn和突觸素、β-微管蛋白在對(duì)照腦組織中共存Fig.2 Double immunofluorescent labeling by polyclonal antibody of α-syn and SYP/β-tubulin antibody

圖3 抗人α-syn多克隆抗體顯示α-syn在腦膜瘤組織中的分布Fig.3 Anatomical distribution of α-syn in meningiomas tissue by polyclonal antibody

3 討論

本課題組采用了2種抗人α-syn抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，均證明α-syn在腦膜瘤組織中腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)與胞核中存在。而在正常腦組織，α-syn免疫活性物質(zhì)除少量存在于神經(jīng)元的胞體和近端突起部位外，主要呈細(xì)小的顆粒狀分布于神經(jīng)元之間，這些α-syn免疫活性物質(zhì)與突觸特異性蛋白突觸素共存，提示α-syn在正常腦組織存在于神經(jīng)末梢的突觸前終末。以往研究［10-11］表明，α-syn 主要存在于具有神經(jīng)元分化特性的腦腫瘤中，而在非神經(jīng)元來源的腦膜瘤則不表達(dá)。本研究結(jié)果表明，非神經(jīng)元來源的腦腫瘤也表達(dá) α-syn。

圖4 3D5顯示α-syn在腦膜瘤組織中的分布Fig.4 Anatomical distribution of α-syn in meningiomas tissue by 3D5

圖5 免疫熒光雙重標(biāo)記顯示α-syn和β-微管蛋白在腦膜瘤組織中共存Fig.5 Double immunofluorescent labeling by polyclonal antibody of α-syn and β-tubulin antibody

α-syn在腦膜瘤細(xì)胞中的功能尚不清楚。以往研究［6-7］表明，α-syn 家族的另一個(gè)成員 γ-syn 與腫瘤細(xì)胞的增生、遷移、侵襲性有關(guān)，γ-syn對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響與其促進(jìn)微管蛋白組裝成微管有關(guān)。鑒于α-syn與γ-syn在氨基酸序列上具有高度的一致性，體外研究［4］證明，α-syn也具有促進(jìn)微管的聚合的作用，推測(cè)α-syn在腦膜瘤細(xì)胞也可能參與微管的形成過程，并進(jìn)而影響腫瘤的增生、遷移和侵襲性。作為支持這一推測(cè)的證據(jù)有α-syn在腦膜瘤細(xì)胞與β-微管蛋白共存，提示α-syn與微管組裝具有密切的關(guān)系。支持以上推測(cè)的另一個(gè)證據(jù)是，本課題組以往的研究［5］表明，α-syn可以促進(jìn)細(xì)胞的增生，而其促進(jìn)細(xì)胞增生的活性部位與其促進(jìn)微管聚合的活性部位相同，均在其蛋白質(zhì)羧基末端。

微管作為細(xì)胞的重要骨架蛋白參與的核分裂與胞質(zhì)分裂過程［12］，而β-微管蛋白是構(gòu)成微管的主要成分。鑒于微管參與細(xì)胞分裂過程中的核分裂和胞體分裂以及腫瘤細(xì)胞的遷移［13-15］，推測(cè) α-syn 也可能與腫瘤的增生、遷移和侵襲性有關(guān)。

［1］Lavedan C.The synuclein family［J］.Genome Res，1998，8(9):871-880.

［2］Hsu L J，Mallory M，Xia Y，et al.Expression pattern of synucleins(non-Ab component of Alzheimer＇s disease amyloid precursor protein/α-synuclein)during murine brain development［J］.J Neurochem，1998，71(1):338-344.

［3］Galvin J E，Schuck T M，Lee V M，et al.Differential expression and distribution of α-，β-，γ-synuclein in the developing human substantia nigra［J］.Exp Neurol，2001，168(2):347-355.

［4］Alim M A，Ma Q L，Takeda K，et al.Demonstration of a role for alpha-synuclein as functional microtubule-associated protein［J］.J Alzheimers Dis，2004，6(4):435-442.

［5］Yin J，Han J，Zhang C，et al.C-terminal part of α-synuclein mediates its activity in promoting proliferation of dopaminergic cells［J］.J Neural Transm，2011，118(8):1155-1164.

［6］Zhang H，Kouadio A，Cartledge D，et al.Role of gammasynuclein in microtubule regulation［J］.Exp Cell Res，2011，317(10):1330-1339.

［7］Liu C，Dong B，Lu A，et al.Synuclein gamma predicts poor clinical outcome in colon cancer with normal levels of carcinoembryonic antigen［J］.BMC Cancer，2010，10:359.

［8］Yu S，Li X，Liu G，et al.Extensive nuclear localization of alpha-synuclein in normal rat brain neurons revealed by a novel monoclonal antibody［J］.Neuroscience，2007，145(2):539-555.

［9］賈春松，李昕，李堯華，等.缺血/再灌注大鼠腦和血漿中α-突觸核蛋白含量的變化［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31(3):368-372.

［10］Kawashima M，Suzuki S O，Doh-ura K，et al.Alpha-synuclein is expressed in a variety of brain tumors showing neuronal differentiation［J］.Acta Neuropathol，2000，99(2):154-160.

［11］Raghavan R，White C L 3rd，Rogers B，et al.Alphasynucelin expression in central nervous system tumors showing neuronal or mixed neuronal/glial differentiation［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2000，59(6):490-494.

［12］Katsetos C D，Herman M M，M?rk S J，et al.ClassⅢ beta-tubulin in human development and cancer［J］.Cell Motil Cytoskeleton，2003，55(2):77-96.

［13］Esteves A R，Arduino D M，Swerdlow R H，et al.Microtubule depolymerization potentiates alpha-synuclein oligomerization［J］.Front Aging Neurosci，2010，1:5.

［14］Nakayama K，Suzuki Y，Yazawa I.Microtubule Depolymerization Suppresses α-synuclein accumulation in a mouse model of Multiple system atrophy［J］.Am J Pathol，2009，174(4):1471-1480.

［15］Zhou R M，Huang Y X，Li X L，et al.Molecular interaction of alpha-synucelin with tubulin influences on the polymerization of microtubule in vitro and structure of microtubule in cells［J］.Mol Biol Rep，2010，37(7):3183-3192.