人參三醇組皂甙對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生和DNA合成的抑制作用

李曉華,王作書(shū),王瑞卿,張 妍,明 月*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 眼科,吉林 長(zhǎng)春130041;2.吉林省消防總隊(duì)醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130061)

人參三醇組皂甙(Panoxatriol saponins,PTS)是由西洋參根中提取,主要含有 Re、Rf、Rg1、Rg2和 Rh1,具有增強(qiáng)免疫功能、促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶、抗衰老、抗腫瘤、清除氧自由、改變碳水化合物和脂質(zhì)代謝等多種生物學(xué)效應(yīng)[1-3];本室以往研究已證實(shí)人參莖葉總皂甙(Ginsenoside of Stems and Leaves,GSL)(含 Rb2、Rc、Rd 、Re、Rf、Rg2)和西洋參根源人參二醇組皂甙(Rb1、Rb2、Rc、Rd)具有抑制 RPE 細(xì)胞增殖的作用,由于PTS與GSL的成分相近,我們進(jìn)一步觀察了PTS對(duì)培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞增生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

培養(yǎng)的RPE細(xì)胞來(lái)源于孕32周流產(chǎn)胎兒人胚眼,主要試劑包括:改良的Eagle培養(yǎng)液(Delbecco,s modified Eagle,s medium DMEM 培養(yǎng)液)(GIBCO),胎牛血清(FCS,GIBCO),溴化二甲噻唑二苯四氮唑藍(lán)(MTT,北京華美生物工程公司),二甲基亞砜(DMSO,國(guó)產(chǎn)分析純),3H-TdR購(gòu)自北京原子能研究所,放射強(qiáng)度為1 mCi。西洋參根源PTS由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院天然藥物化學(xué)研究室惠贈(zèng),淡黃色粉末,實(shí)驗(yàn)前用DMEM溶解配成不同濃度。

1.2 方法

1.2.1RPE細(xì)胞的培養(yǎng) 人胚眼球在無(wú)菌條件下,沿扁平部剪開(kāi),剔除前部組織、玻璃體及視網(wǎng)膜感覺(jué)部,后節(jié)眼杯用PBS液漂洗后在解剖顯微鏡下分成4塊展平后,放入DMEM培養(yǎng)液中,顯微鏡下剝離RPE層,將得到的 RPE置于0.25%胰蛋白酶(trypsin)中消化30 min,FCS終止消化,注吸法分離RPE,離心、清洗后接種于含20%FCS的DMEM 培養(yǎng)液,置于37℃,5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。RPE細(xì)胞為貼附型細(xì)胞,取第5代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2藥物濃度與效應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn) RPE細(xì)胞經(jīng)酶消化后制成細(xì)胞密度2×104/ml細(xì)胞懸液,每孔2 ml接種于24孔塑料培養(yǎng)板,孵育24 h后加入PTS,使其終濃度為 0 、5、10、50、100、150、200、300、40、500 μ g/ml,每種濃度3孔,培養(yǎng)12 h后,更換成不含藥物的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,Trypsin消化制成細(xì)胞懸液,給藥組和對(duì)照組各取3孔臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù),計(jì)算抑制率。細(xì)胞活力測(cè)定:取各樣本細(xì)胞懸液0.9 ml加入1%臺(tái)盼藍(lán)0.1ml,混勻,血細(xì)胞計(jì)數(shù)板盲法計(jì)數(shù),著色細(xì)胞為死細(xì)胞,以活細(xì)胞數(shù)占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分比反應(yīng)細(xì)胞活力。

1.2.3時(shí)間與藥物效應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn) 同上接種細(xì)胞,孵育24 h后加PTS使其終濃度200 μ g/ml,對(duì)照組加入等量的DMEM培養(yǎng)液。分別于培養(yǎng)12、24、48、72、96和120 h經(jīng)Trypsin消化后臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù),計(jì)算增生抑制率。

1.2.4MTT比色法 取密度為4×104/mlRPE細(xì)胞懸液200ul接種于96孔板,孵育24 h后棄液,加入含PTS的培養(yǎng)液,PTS終濃度分別為50、100、200、300 、400 μ g/ml,對(duì)照 組加入等量 DMEM 培養(yǎng) 液,每組3復(fù)孔。培養(yǎng)12 h后用培養(yǎng)液漂洗細(xì)胞1次,加入 5 mg/mlMTT(Sigma)10 μ l和 190 μ lDMEM,繼續(xù)培養(yǎng) 6 h,棄液 ,每孔加入 DMSO 100 μ l,振搖 10 min,用Bio-RAD550型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)下讀取吸光值(A值),進(jìn)行t檢驗(yàn)并計(jì)算生存率和EC50。

1.2.53H-TdR摻入法步驟同1.2.4,給藥后培養(yǎng)24 h,每孔加入3H-TdR1 μ Ci,繼續(xù)培養(yǎng) 12h,Trypsin 消化制成細(xì)胞懸液,收集細(xì)胞于纖維濾膜,洗滌,涼干后置入閃爍瓶中,加入二甲苯閃爍液,用液化閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分鐘計(jì)數(shù)值(counts per minute,CPM),進(jìn)行t檢驗(yàn)并計(jì)算摻入抑制率。

2 結(jié)果

2.1劑量-效應(yīng)關(guān)系RPE細(xì)胞數(shù)隨PTS濃度增加而減少,PTS 在5 、10、50 、100、200、300 、400 、500 μ g/ml對(duì)細(xì)胞增生的抑制率依次為22.02%、37.00%、48.62%、64.53%、74.92%、81.96%、83.18%和82.26%。

2.2時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系貼壁生長(zhǎng)良好的RPE細(xì)胞在給藥后12 h可見(jiàn)部分細(xì)胞脫落,在所觀察的12、24、48、72、96、120 h 點(diǎn),與對(duì)照組相比 PTS 組 RPE 細(xì)胞增生的抑制率分別為37.93%、59.53%、74.64%、79.11%、80.91%和80.53%;于給藥后96 h內(nèi),其抑制效應(yīng)隨時(shí)間而明顯增強(qiáng),各組細(xì)胞活力均在90%以上。

2.3PTS對(duì)RPE細(xì)胞增殖的抑制作用PTS的A值明顯低于對(duì)照組(見(jiàn)表 1),其中50 μ g/ml組 P＜0.05,其余 4 組(100、200、300、400 μ g/ml)P ＜0.01:PTS 對(duì)人胚RPE細(xì)胞的EC50為64.3 μ g/ml。

表1 不同濃度PTS作用下RPE的生存率

2.4PTS對(duì)RPE細(xì)胞DNA合成的抑制作用PTS組CPM值隨藥物濃度增加而降低(見(jiàn)表2)。

3 討論

增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(Proliferative vitreoretinopathy,PVR)被認(rèn)為是眼內(nèi)炎癥、孔源性視網(wǎng)膜脫離(Retinal Detachment,RD)、外傷、眼內(nèi)手術(shù)后的損傷修復(fù)過(guò)程,是由多種細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、膠原和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的病理過(guò)程。病理學(xué)研究表明視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)是發(fā)生PVR時(shí)最重要的細(xì)胞,RPE在病理情況下可移行至玻璃體內(nèi)并在玻璃體內(nèi)散布、增生、合成膠原及其它細(xì)胞基質(zhì),并具有成纖維細(xì)胞樣作用[4]。PVR是引起視力障礙甚至失明的嚴(yán)重眼病之一,是導(dǎo)致RD手術(shù)失敗的最常見(jiàn)原因。玻璃體手術(shù)雖可有效治療PVR,但術(shù)后仍有一些病人復(fù)發(fā),最終導(dǎo)致視力喪失,探討PVR的藥物治療逐漸成為國(guó)內(nèi)外眼科工作者的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT比色法和3HTdR摻入法探討PTS對(duì)RPE細(xì)胞增生的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTS對(duì)培養(yǎng)人胚RPE細(xì)胞增生具有抑制作用,在一定時(shí)間(96小時(shí))和劑量范圍內(nèi)(50 μ g/ml至400 μ g/ml)存在時(shí)間依賴和劑量依賴關(guān)系。我們還發(fā)現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)良好的RPE細(xì)胞在給藥后12小時(shí)即可見(jiàn)部分細(xì)胞脫落,貼附是貼附型細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的條件之一,通常細(xì)胞表面有由細(xì)胞分泌的糖蛋白膜,即細(xì)外衣,它對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)尤其是貼附于支持物生長(zhǎng)有重要作用[5]。細(xì)胞外衣的性質(zhì)與細(xì)胞物質(zhì)膜電位、酸堿失衡有關(guān),改變細(xì)胞外衣的性質(zhì)可使細(xì)胞由支持物上脫落下來(lái)。有研究表明RPE細(xì)胞中游離鈣的濃度調(diào)節(jié)細(xì)胞吞噬功能狀態(tài)、細(xì)胞增殖及細(xì)胞與基底膜的粘附力[6];同時(shí)鈣離子還是細(xì)胞收縮、吞噬、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝及酶活性調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)調(diào)控者[7]。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)PTS和所含單體Rg1、Re具有抑制細(xì)胞外鈣內(nèi)流降低膜電位[8-10];此外,PTS中單體Rg2還具有抑制鈉內(nèi)流的作用[11]。由此推測(cè)PTS可能可能通過(guò)阻滯鈣通道改變細(xì)胞內(nèi)鈣濃度引起細(xì)胞粘附力、增殖力下降,同時(shí)干擾細(xì)胞內(nèi)酶活性和物質(zhì)代謝;同時(shí)通過(guò)抑制鈣和鈉離子內(nèi)流改變膜電位抑制RPE過(guò)度增增殖。由于正常活細(xì)胞線粒體內(nèi)活性脫氫酶可將MTT還原為紫色的甲潛(formazan),且細(xì)胞的存活數(shù)與其產(chǎn)生的甲潛的A值之間存在線性關(guān)系。MTT比色法發(fā)現(xiàn)給藥組細(xì)胞甲潛產(chǎn)生量少于對(duì)照組,A值明顯低于對(duì)照組,細(xì)胞生存率隨藥物濃度增加而下降,進(jìn)一步證實(shí)PTS可干擾細(xì)胞代謝。Popovich等證實(shí)PTS可導(dǎo)致人白血病細(xì)胞THP-1的DNA斷裂[12],本實(shí)驗(yàn)通過(guò)3H-TRP摻入實(shí)驗(yàn)證實(shí)PTS可抑制RPE細(xì)胞DNA合成,其抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)藥物隨濃度的增加而增強(qiáng)。

表2 人胚RPE細(xì)胞在PTS作用下DNA合成抑制率

PTS可通過(guò)抑制DNA合成,并可能通過(guò)抑制鈣和鈉的內(nèi)流、改變膜電位、干擾細(xì)胞代謝、改變細(xì)胞外衣的性質(zhì)而抑制RPE細(xì)胞增殖。PTS作用與PDS相似,PTS能否抑制RNA、膠原合成及對(duì)PVR動(dòng)物的治療作用尚在研究中,PTS有望成為治療PVR的有效藥物。

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