白樺木材藍變生防菌(Bacillus subtilis)B26液體發酵條件的優化1)

韓 麗 常建民 張柏林 孫 薇 王 雨

(北京林業大學，北京，100083)

20世紀80年代以來，化學藥劑防治木材藍變引起的環境污染等一系列問題日益引起世界各國政府的廣泛關注，尋找對環境友好、無毒高效的防治技術成為木材保護領域的研究熱點。生物防治被認為是最具發展潛力的防治技術之一，而基礎是獲得高效生防菌株并使其作用充分發揮［1－5］。枯草芽孢桿菌由于抗逆性強、抗菌譜廣泛，被認為是理想生防菌來源之一，在植物病害生物防治領域已得到了廣泛的研究與應用，但用于木材藍變防治的研究還較少［6－8］。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B26是北京林業大學木材生物防治實驗室分離、篩選、鑒定和保存的一株優良生防細菌［9］。在前期平板試驗和室內木片試驗中，B26菌株對白樺木材藍變菌表現出明顯的拮抗作用，顯示了較高的研究價值和應用潛能。由于生防菌對病原菌的抑制效果不僅取決于菌株本身，還取決于外界條件，包括培養基成分和培養條件等。因此本研究采用單因素試驗和正交試驗對B26菌株液體發酵條件進行優化，得到其最適培養基和最適培養條件，以期為該菌株的進一步開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

生防菌枯草芽孢桿菌B26和病原菌綠色木霉均由北京林業大學木材生物防治實驗室分離、篩選、鑒定和保存。

種子液培養基為NB培養基，抑菌活性檢測培養基為PDA培養基，制備方法參考張紀忠方法［10］。

碳、氮源試驗專用培養基:(NH4)2SO42 g、NaH2PO40.50 g、K2HPO40.50 g、MgSO40.20 g、CaCl20.10 g、蒸餾水1000 mL。

1.2 研究方法

1.2.1 種子液制備

將斜面保存的B26菌株接一環到種子液培養基中，裝液量100 mL(容器容量250 mL)，溫度(28±1)℃，轉速110 r/min，振蕩培養48 h后，按5%的接種量接入不同條件下的發酵培養液中，進行相關單因素的發酵試驗。

1.2.2 培養基的優化

采用碳、氮源試驗專用培養基，分別以不同碳源(乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精)和不同氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、(NH4)2SO4、NaNO3)替代培養基中的碳氮源，其他成分固定不變，裝液量100 mL(容器容量250 mL)，接種量5%，溫度(28±1)℃、速度110 r/min，振蕩培養48 h后檢測不同碳源、氮源對B26菌株發酵液抑菌活性的影響。每處理3次重復。

在單因子試驗基礎上進一步優化培養基配方，采用L9(34)正交表安排試驗，明確碳源、氮源、CaCl2、MgSO4·7H2O的最適添加量。每處理3次重復。

1.2.3 培養條件的優化

采用1.2.2優化后的培養基，分別檢測不同培養溫度、初始pH、裝液量、搖瓶轉速、接種量和培養時間對B26菌株發酵液抑菌活性的影響。每處理3次重復。

1.2.4 發酵液抑菌活性檢測方法

取不同發酵條件下振蕩培養48h的發酵液，在4℃、9 000 r/min下，離心20 min，去除大量菌體和雜質，取其上清液，置于4℃下保存備用。

采用孔碟法檢測發酵液抑菌活性［11］。具體操作為:配制病原真菌的孢子懸浮液，取2 mL移至培養皿中。將冷卻到約45℃的PDA培養基倒于培養皿中(約20 mL)，搖均，在離培養平板邊緣2 cm的地方用內徑為6 mm的打孔器打孔，每皿打4個孔(孔間距離為2 cm)。將25 μL的發酵上清液置于孔中，在28℃下培養4～7 d，采用十字交叉法測定抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 培養基的優化

2.1.1 碳源和氮源對B26菌株抑菌活性的影響

對常見的6種碳源:乳糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精(碳源質量分數為1.5%)的研究結果見表1。可知，培養基中碳源種類不同，B26菌株發酵液對變色菌抑制效果不同，以蔗糖為碳源時，發酵液抑菌活性最佳，抑菌圈直徑可達到17.02 mm;其后依次是葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、乳糖、麥芽糖。

對常見5種氮源:牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、(NH4)2SO4、NaNO3(有機氮源質量分數為1.5%，無機氮源質量分數為0.5%)的研究結果見表2。可知，B26菌株對有機氮源的利用普遍好于無機氮源。在有機氮源中，以蛋白胨為氮源的發酵液抑菌活性最佳，抑菌圈直徑可達18.16 mm;在無機氮源中，以NaNO3為氮源的發酵液抑菌活性最好，抑菌圈直徑為13.62 mm。

表1 不同碳源對B26菌株抑菌活性的影響

表2 不同氮源對B26菌株抑菌活性的影響

2.1.2 培養基的正交優化

通過上述碳源和氮源單因素試驗的研究，確定了液體發酵培養基的最佳碳源和氮源的種類。為進一步優化培養基配方，選取發酵培養基的主要成分蔗糖、蛋白胨、CaCl2、MgSO4·7H2O，進行L9(34)正交試驗。正交試驗各因素及水平見表3，統計結果及方差分析見表4與表5。由表4中R值可看知，影響B26菌株發酵液抑菌活性的因素依次為:B(蛋白胨)＞A(蔗糖)＞D(MgSO4·7H2O)＞C(CaCl2)。結合K值，本研究中選出的最佳培養基組合為B1A1D3C2，即蔗糖1.5%、蛋白胨1.5%、CaCl20.15%、MgSO4·7H2O 0.20%。

表3 培養基優化的正交試驗因素水平

表4 培養基優化的正交試驗結果

表5 正交設計方差分析

由表5中的方差分析可知:FB(6.78)＞FA(6.13)＞FD(5.90)＞FC(2.83)，表明蔗糖、蛋白胨、CaCl2、MgSO4·7H2O對發酵液抑菌活性的影響均不顯著。

2.2 培養條件

2.2.1 溫度對B26菌株抑菌活性的影響

將 B26菌株分別置于 20、25、30、35、40、45 ℃下搖瓶培養，測定培養溫度對菌株發酵液抑菌活性的影響，結果見表6。可知，溫度對B26菌株發酵液抑菌活性有一定影響。在20～45℃范圍內，發酵液的抑菌活性相差不大，在35℃時菌株發酵液抑菌活性最高。隨著溫度的進一步升高，發酵液抑菌活性急劇下降，說明溫度過高或過低都不利于B26菌株的發酵。

表6 溫度對B26菌株抑菌活性的影響

2.2.2 裝液量對B26菌株抑菌活性的影響

將 B26 菌株接入分別裝入 30、60、90、120、150、180 mL 培養液的250 mL三角瓶中，比較不同裝液量對發酵液抑菌活性的影響(見表7)。結果表明，裝液量為120 mL時，菌株發酵液抑菌活性最強，說明該菌株為好氧菌，發酵液抑菌活性與通氣條件有一定要求，裝液量過少或過大，都不利于菌株的發酵。

表7 裝液量對B26菌株抑菌活性的影響

2.2.3 轉速對B26菌株抑菌活性的影響

搖床轉速分別設定為 90、110、130、150、170、190 r/min，結果見表8。在轉速為130 r/min時，B26菌株發酵液抑菌活性最好，抑菌圈直徑可達16.36 mm。當轉速超過170 r/min時，發酵液的抑菌活性顯著下降，說明轉速太高不利于菌株生長，可能會導致菌體細胞機械損傷而影響其生長，或引起菌體自溶，從而對發酵抑菌活性產生很大的影響。

表8 搖瓶轉速對B26菌株抑菌活性的影響

表9 初始pH對B26菌株抑菌活性的影響

2.2.4 初始pH對B26菌株抑菌活性的影響

測定了 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0 等不同初始 pH 值對B26菌株發酵液抑菌活性的影響(見表9)。結果表明，pH為7.5時菌株發酵液的抑菌活性最高，抑菌圈直徑可達19.00 mm。當pH為6.5～8.0時，B26菌株發酵液抑菌活性較高，說明中性及弱堿性的培養條件更有利于B26菌株對病原菌的抑制作用。

2.2.5 接種量對B26菌株抑菌活性的影響

分采用2%、4%、6%、8%、10%、12%等6個接種量梯度進行搖瓶培養，測定接種量對發酵液抑菌活性的影響(見表10)。可見，在一定范圍內菌株抑菌活性隨接種量的增加而增加，接種量在8%時發酵液抑菌活性最高，當接種量大于10%，發酵液抑菌活性開始降低。因此最適接種量為8%。

表10 接種量對B26菌株抑菌活性的影響

2.2.6 發酵時間對B26菌株抑菌活性的影響

從表11中可以看出，隨著發酵時間的延長，發酵液的抑菌活性呈上升趨勢，在培養36～72 h內抑菌活性最大并呈平穩趨勢，其中72 h時發酵液抑菌活性最大，之后發酵液活性呈現下降趨勢。因此菌株以培養72 h最為適宜。

表11 發酵時間對B26菌株抑菌活性的影響

3 結論

通過對枯草芽孢桿菌B26液體發酵條件的優化，確定了菌株抑菌活性最高的培養基配方及培養條件:蔗糖1.5%+蛋白胨 1.5%+CaCl20.15%+MgSO4·7H2O 0.20%;溫度為 35℃、初始pH值7.5、裝液量120 mL、接種量8%、轉速130 r/min，發酵時間72 h。在該優化條件下，發酵液抑菌圈直徑從最初的12.40 mm提高到了19.00 mm，抑菌活性比優化前提高了53%。優化得到的培養基成分是工業生產中較常用的原料，培養條件在工業生產中也較易達到，這為B26菌株的發酵罐放大試驗提供了理論依據，也為菌株的進一步工業化開發打下基礎。

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