阿托伐他汀對CLP大鼠模型的保護作用

曲茂興，于 健*，李春樹，呂慧怡

膿毒癥(Sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應，發病率有逐年上升趨勢，是ICU患者死亡的主要原因之一［1］。阿托伐他汀是臨床常用的調脂藥，大規模臨床試驗證明，它可顯著降低心血管疾病的致殘率和死亡率［2－5］，同時具有抗炎［6－11］、改善內皮細胞功能和NO活性等作用［12－14］。本實驗采用盲腸結扎穿孔術(CLP)建立膿毒癥大鼠模型，觀察阿托伐他汀對大鼠血漿一氧化氮(NO)和肝組織勻漿丙二醛(MDA)的影響，探討阿托伐他汀的臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 儀器設備 DS－88型電子秤(武漢自動化儀表廠)，TG16WS高速臺式離心機(長沙科學儀器廠)，UV－2100 Spectrophotometer紫外/可見分光光度計(日本島津公司)，XW－80A旋渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)，HH－W21－600電熱恒溫水浴箱(上海醫用恒溫設備廠)。

1.2 試劑和材料 阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司生產，批號:081128);一氧化氮(NO)，微量丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 動物分組及給藥 75只健康雄性SD(Sprague－Dawley)大鼠，體質量184～202 g，購于大連醫科大學實驗動物中心。按照隨機排列表法分為3組，每組25只。對照組用食用淀粉40 mg/kg加入2mL生理鹽水，制成混懸液，連續灌胃5 d，第6日行假手術。膿毒癥組同樣用食用淀粉灌胃，第6日行CLP，用絲線結扎盲腸總長度的30%［15］，在盲腸游離端選2個相距3mm點分別刺穿盲腸，術后置籠內活動，不禁飲食。阿托伐他汀組，用阿托伐他汀40 mg/kg［16］溶于2mL生理鹽水，制成混懸液，連續灌胃5 d，第6日行CLP。

1.4 標本收集及檢測 分別在術后0、2、6、10、24 h時間點眼眶采血，肝素抗凝管靜置30min，4℃、3000 r/min離心15min，取血漿于－20℃冰箱中保存。剪取肝臟組織在冰冷的生理鹽水中漂洗，濾干，稱濕重約0.1 g倒入玻璃勻漿管中，加入1mL 0.86%冷生理鹽水研磨，使組織勻漿化，4℃、2000 r/min離心15min，取上清于－20℃冰箱中保存。用分光光度計檢測血漿NO、肝臟組織勻漿MDA的含量。24 h時間點取心臟、肺、肝臟、空腸標本，置10%甲醛溶液中固定，依次常規脫水，石蠟包埋，制成切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，光鏡下檢查組織病理學改變。

1.5 統計學方法 采用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以表示，正態分布變量多組間比較用方差分析，3個處理組均數的兩兩比較用LSD－t檢驗法，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血漿NO的比較 2 h時對照組與膿毒癥組(P=0.029)和阿托伐他汀組(P=0.038)比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。膿毒癥組在術后6 h明顯升高，24 h達到峰值(329.04±21.15)μmol/L;阿托伐他汀組在術后10 h明顯升高，在24 h達到峰值(209.53±10.68)μmol/L。在0 h和2 h時間點，阿托伐他汀組與膿毒癥組比較，差異無統計學意義(P ＞0.05)，在 6 h、10 h、24 h時間點，阿托伐他汀組與膿毒癥組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)，見圖1。

圖1 各組血漿NO濃度的比較

2.2 各組肝組織勻漿MDA的比較 膿毒癥組和阿托伐他汀組MDA含量在術后2 h升高，6 h、10 h無明顯變化，于24 h再度回升并分別達到峰值(8.22±0.54)nmol/mgprot和(6.32±0.35)fnmol/mgprot。在 2 h、6 h、10 h、24 h，阿托伐他汀組MDA含量均低于膿毒癥組，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。見圖2。

圖2 各組肝組織勻漿丙二醛水平的比較

2.3 光學顯微鏡檢查 心臟:對照組無明顯病理改變或間質血管充血(圖3A)。膿毒癥組部分心肌變性，血管充血明顯(圖3B)。阿托伐他汀組少量心肌變性，間質血管充血(圖3C)。肺:對照組肺泡間隔無增寬，無炎性細胞浸潤(圖4A)。膿毒癥組肺泡間隔明顯增寬，淋巴細胞、漿細胞浸潤，血管擴張充血，其周圍炎細胞浸潤明顯(圖4B)。阿托伐他汀組肺泡間隔略增寬，少量淋巴細胞、漿細胞浸潤(圖4C)。空腸:對照組腸粘膜正常(圖5A)。膿毒癥組腸粘膜部分上皮脫落，重度炎癥(圖5B)。阿托伐他汀組腸粘膜中度炎癥(圖5C)。肝臟:對照組無明顯病理改變或肝細胞輕度水腫，匯管區少量淋巴細胞浸潤(圖6A)。膿毒癥組肝細胞高度水腫、變性(圖6B)。阿托伐他汀組肝血管略充血，肝細胞水腫較輕(圖6C)。

3 討論

本次試驗采用CLP復制膿毒癥大鼠模型［17－18］。CLP模型操作簡單，通過外科處理使動物腹腔存在失活組織的同時，少量持續溢入混有多種細菌的腸內容物，引起腹腔感染，與臨床上闌尾炎穿孔形成的憩室炎極為相似［19－20］，既可以使膿毒癥得到充分發展，也可以保證膿毒癥大鼠模型在24 h內的存活率。進入腹腔的細菌釋放，刺激單核細胞、巨噬細胞和內皮細胞等產生多種促炎細胞因子，可迅速活化不同組織器官的細胞，導致機體代謝、激素水平和神經內分泌改變，造成細胞功能異常和器官功能衰竭。內毒素也激活生理狀態下沒有活性的誘導型一氧化氮合酶(iNOS)并大量表達，產生過量的NO，促使大量的中性粒細胞活化，引起“呼吸爆發”，產生大量的氧自由基，促進炎性滲出和組織損傷。MDA是體內自由基代謝產生的脂質過氧化產物，可以反映脂質過氧化自由基的存在及反應的程度［21］。他汀類藥物能抑制iNOS的表達，下調NO的合成，從而改善膿毒癥的預后。

本次試驗中，膿毒癥組血漿NO濃度在術后6 h顯著升高，24 h達到峰值(329.04±21.15)μmol/L。在阿托伐他汀干預后，血漿NO的濃度在術后10 h才顯著升高，術后24 h達到峰值(209.53 ±10.68)μmol/L。在6 h、10 h、24 h時間點，阿托伐他汀組大鼠血漿中NO的濃度較膿毒癥組明顯降低(P＜0.01)。阿托伐他汀可以降低膿毒癥大鼠血漿中NO的濃度。在膿毒癥組，術后24 h肝組織勻漿MDA含量的峰值為(8.22±0.54)nmol/mgprot，阿托伐他汀組為(6.32±0.35)nmol/mgprot，在術后 2 h、6 h、10 h、24 h，阿托伐他汀組肝組織勻漿MDA含量均低于膿毒癥組(P＜0.05或P＜0.01)，說明阿托伐他汀也可以降低膿毒癥大鼠肝組織勻漿中MDA的含量。與膿毒癥大鼠高濃度的NO和MDA相對應，24 h后光鏡下檢查發現，膿毒癥組心臟﹑肺﹑肝臟﹑空腸有明顯病理改變，炎細胞浸潤，組織充血、壞死、滲出，表現為重度炎癥，提示膿毒癥時心臟﹑肺﹑肝臟﹑空腸都可能受累。阿托伐他汀干預后，心臟﹑肺﹑肝臟﹑空腸光鏡下的病理改變較膿毒癥組有一定程度的改善。說明阿托伐他汀可能減輕膿毒癥大鼠模型的炎癥反應，因此，推測在膿毒癥患者中應用他汀類藥物可能具有一定的臨床意義。

圖3 光學顯微鏡下大鼠心臟24 h病理改變(HE×400)

圖4 光學顯微鏡下大鼠肺臟24 h病理改變(HE×200)

圖5 光學顯微鏡下大鼠空腸24 h病理改變(HE×200)

圖6 光學顯微鏡下大鼠肝臟24 h病理改變(HE×200)

“拯救膿毒癥戰役”(SSC)會議推薦早期集束化治療:液體復蘇，血管活性藥物，控制血糖，小劑量激素，機械通氣以及重組人體活化蛋白 C(rhAPC)用于治療膿毒癥休克等，但目前仍沒有特效治療方法。雖然FDA批準他汀類藥物僅作為調脂及抗動脈粥樣硬化使用，也許它的保護作用可以給我們新的啟發和思路。

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