乳酸桿菌的分離、鑒定及體外拮抗試驗

蘆 珂

（四川省雅安職業技術學院藥學檢驗系，四川 雅安 625000）

為了篩選性狀優良的多種菌株，開發出多種效果優良的微生態制劑，本試驗針對乳酸桿菌對大腸桿菌的生物拮抗作用，進行微生態制劑菌種篩選的第一步工作，即體外試驗，以判斷候選菌是否表現出對病原菌的拮抗作用，為后續試驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器 培養皿、移液管、牛津杯、微型發酵管（空管）、針頭、試管、蒸餾水、三角棒、微量加樣槍槍頭、注射器、離心管等器具，均已作高壓濕熱滅菌。

1.1.2 培養基 LBS乳酸桿菌選擇培養基的制備：蛋白胨2 g、牛肉膏2 g、酵母浸膏1 g、葡萄糖4 g、醋酸鈉1 g、吐溫-80 0.2mL、磷酸氫二鉀0.4 g、枸櫞酸三氨0.4 g、七水硫酸鎂0.04 g、四水硫酸鎂0.01 g、瓊脂粉1.6g、蒸餾水200mL。混合以上成分，加熱溶解、冷卻后，pH值調至6.0～6.5，121℃滅菌20min。

EMB培養基的制備：蛋白胨2 g、乳糖2 g、磷酸氫二鉀 0.4 g、伊紅 0.08 g、美藍 0.013 g、瓊脂粉 1.6 g、蒸餾水200mL。除伊紅、美藍外將其余成分混合于200mL水中，加熱溶解，調至pH為7.2，再分別加入伊紅、美藍混勻，121℃滅菌15min。

營養瓊脂培養基的制備：牛肉膏 1g、蛋白胨2g、氯化鈉1g、瓊脂粉1.6g、蒸餾水200mL。于200mL水中加入以上營養成分，加熱煮沸使其溶解，調整pH值至7.6，121℃滅菌15min。成分中去除瓊脂粉即為營養肉湯。

糖醇發酵培養基的制備：蛋白胨1 g、牛肉膏1 g、酵母膏1g、吐溫-80 0.1mL、糖醇類（棉籽糖、麥芽糖、鼠李糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖、山梨醇）各2 g、蒸餾水200mL。調pH值至7.0，滅菌后，加入1.6%溴甲酚紫溶液1.4mL，然后分裝（無菌操作），制成含不同糖或醇的發酵管培養基。

七葉苷、精氨酸微量發酵管：購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸桿菌的分離純化 分別取豬糞、牛糞、雞糞約1 g，加99mL生理鹽水，室溫下150 r/min搖床振搖15～30min。分別在LBS培養基上劃線，將劃線的LBS培養基放入厭氧罐中于37℃培養48h。觀察菌落生長情況，取單一菌作純化劃線培養，連續純化3次。

1.2.2 菌種的鑒定 菌落和細菌形態的觀察：經純化的菌株，劃線接種于相應的選擇培養基上。把LBS培養基放入厭氧罐中37℃培養48 h，觀察菌落的情況。取單一菌落制涂片進行革蘭氏染色，鏡檢菌體形態特征。

生理生化鑒定：將純化的菌株接種于自制的微量發酵管及七葉苷、精氨酸微量發酵管中，連續觀察3 d。

1.2.3 大腸桿菌菌懸液的制備 取上述豬糞稀釋液在EMB培養基上劃線，然后置于37℃培養箱中需氧培養24 h，觀察菌落生長情況，取具有藍紫色金屬光澤的單一菌落作純化劃線培養，連續純化3次，并作革蘭氏染色，鏡檢菌體形態特征是否符合大腸桿菌的特征。將菌落特征和鏡檢結果明確并純化的大腸桿菌接種于50mL營養肉湯中，置于37℃搖床（150 r/min）培養24 h，然后對大腸桿菌培養液稀釋100倍。

1.2.4 生物拮抗試驗 將鑒定的菌株接種于50mL營養肉湯，乳酸桿菌放入厭氧罐中37℃培養48h。取0.1mL稀釋好的大腸桿菌菌液到營養瓊脂平板，用滅菌冷卻的三角棒涂布均勻，干燥15～30min。放置滅菌冷卻的牛津杯，每個平板放3個，一次到位。用吸管分別吸取乳酸桿菌上清液（3000 r/min，20min）以及乳酸桿菌全菌液，加滿牛津杯。置37℃溫箱中培養24h，觀察抑菌圈大小，并用游標卡尺測量抑菌圈的直徑。

2 結果與分析

2.1 乳酸桿菌的分離純化結果 在LBS劃線培養的菌株中隨機挑選1株菌株，進行純化培養，雞糞菌株代號為LBJ、豬糞菌株代號為LBZ、牛糞菌株代號為LBN。

2.2 乳酸桿菌的鑒定結果

2.2.1 菌落特征及細菌形態特征 LBJ菌株在LBS培養基上呈乳白色、半透明、光滑、圓形的菌落。LBZ菌株和LBN菌株在LBS培養基上呈乳白色、光滑、圓形的菌落，較雞糞中分離的菌落略大。

LBJ菌株為革蘭氏陽性菌，無芽孢，散在；LBZ菌株為革蘭氏陽性菌，無芽孢，較LBJ菌株略大，散在；LBN菌株為革蘭氏陽性菌，無芽孢，單個或成雙存在，菌體長。

2.2.2 生理生化鑒定結果 3次重復的微量發酵管培養結果見表1。除七葉苷、精氨酸外，接種前為灰色，接種后陽性反應為變黃，陰性為顏色不變。七葉苷接種前為淡紫色，陽性反應為黃色，陰性反應為深紅色。以上微量發酵管除精氨酸外，其余都為糖、醇發酵，精氨酸發酵是為了驗證有無氨氣產生，接種前為綠色，陽性反應為黃色，陰性反應為紫色。

表1 微量發酵管培養結果

2.2.3 鑒定結果 根據菌落特征和細菌形態，3株菌都符合乳酸桿菌的特征。生化培養結果，查《伯杰氏手冊》，LBJ屬于發酵乳桿菌，LBZ屬于木糖乳桿菌，LBN屬于發狀乳桿菌。手冊中發酵乳桿菌在甘露糖項為弱反應，實際觀察結果為陽性；木糖乳桿菌在乳糖項為株間不同，實際觀察結果為陽性；發狀乳桿菌在鼠李糖、山梨醇項未作試驗，實際結果為陽性。

2.3 生物拮抗試驗結果 在生物拮抗試驗中發現，只有從雞糞中分離的乳酸桿菌（LBJ）對分離的大腸桿菌有拮抗作用，而從牛糞、豬糞中分離的乳酸桿菌沒有拮抗作用，具體見表2。在LBJ菌株的拮抗作用中，我們發現上清液的作用明顯大于全菌液，差異顯著（P<0.05）。

3 討論與結論

3.1 乳酸桿菌的分離鑒定 孟軍、劉淑英等在分離和鑒定雞源乳酸桿菌時所用的方法是將增菌培養后的菌液在培養基上作劃線分離培養，從中選取各個形態不同的菌落，再進行劃線分離和純化培養，最后得到多種乳酸桿菌菌株。劉立恒在乳酸桿菌分離前進行了耐酸篩選和耐膽鹽篩選，這樣可以保證篩選出的菌株在腸道定植的可能性。本試驗在對牛糞、雞糞、豬糞的乳酸桿菌分離純化中，每個樣品隨機傳代并純化一個生長迅速的菌落，得到牛、雞、豬乳酸桿菌菌株各1株，再對其進行形態和生化鑒定。

表2 生物拮抗試驗結果（抑菌圈直徑：mm）

3.2 生物拮抗作用 本試驗結果表明，來自牛、豬、雞的 3株乳酸桿菌（LBN、LBZ、LBJ）對豬源大腸桿菌有不同的作用。LBJ菌株對豬源大腸桿菌有拮抗作用，其余兩株沒有。而LBJ乳酸桿菌的培養上清液和全菌液對豬源大腸桿菌的拮抗作用效果亦不同。上清液的生物拮抗作用大于全菌液的生物拮抗作用，分析原因可能有：（1）就代謝產物來說，上清液純度、濃度大于全菌液；（2）由于分離了菌體，有可能黏度減小，擴散能力增強；（3）由于在生物拮抗試驗中沒有將培養基放在厭氧罐中，而乳酸桿菌為兼性厭氧菌，在氧濃度相對較高的條件下沒有產生乳酸，從而使試驗結果受到影響；（4）在使用牛津杯的過程中，有可能菌體沉淀集聚在牛津杯的底部邊緣生長，從而影響了代謝產物的滲透作用。

3.3 結論 此次試驗分別從雞糞、牛糞、豬糞中分離純化出發酵乳桿菌、發狀乳桿菌、木糖乳桿菌；體外生物拮抗試驗的結果是雞源發酵乳桿菌對豬源大腸桿菌有拮抗作用，而牛源發狀乳桿菌和豬源木糖乳桿菌對大腸桿菌沒有拮抗作用，且雞源發酵乳桿菌的上清液對大腸桿菌的拮抗作用大于全菌液。

[1]何明清.動物微生態學[M].北京：中國農業出版社，1992.

[2]亦 云.乳酸菌類微生物制劑的作用機理及其應用[DB].微生物特色學科信息門戶，2006，3（1）：34-38.

[3]郭興華.益生菌基礎與應用[M].北京科技出版社，2002：76-93.

[4]張 媛，毛玉杰.乳酸桿菌及其在微生態制劑中的作用[J].遼寧畜牧獸醫，2004，（2）：42-43.

[5]Pascual M，Hugas M，Badjola J I，et al.Lactobacillus salivarius CTC2197 prevents salmolella enteritidis cololization in chickens[J].Appl and environ Microbil，1999，65：4981-4986.

[6]王麗莉，陳其御.人陰道乳酸桿菌對大腸桿菌的體外拮抗作用[J].江蘇醫藥，2005，31（9）：662-663.

[7]楊廷彬.LBS培養基的制法[Z].培養基手冊.

[8]凌代文，等.乳酸細菌分類鑒定及試驗方法[M].北京：中國輕工業出版社，1991.

[9]劉長建，徐洪濤，權春善，等.乳酸菌素生產菌的分離與鑒定[J].食品與發酵工業，2005，31（7）：26-30.

[10]M.Garriga，M.Pascual，et al.Selection of Lactobacillus for chichen probiotic adjuncts[J].J Appl Microbil，1998，84：125-132.

[11]祝嫦巍，王昌祿，顧曉波，等.新型乳桿菌素產生菌的篩選及菌株特性的研究[J].氨基酸和生物資源，2002，24（1）：22-25.

[12]趙 斌，何紹江.微生物學實驗[M].北京：科學出版社，2002.

[13]R.E.布瑞德，N.E吉本斯，等.乳酸桿菌屬的鑒定[A].伯杰細菌鑒定手冊（8版）[M].北京：科學出版社，1984.