連用DCS與顯微方法的冷凍干燥系統(tǒng)及實(shí)驗(yàn)研究

王海燕 倫照榮 呂樹申

(1 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院 廣州 510275; 2 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510275)

冷凍干燥技術(shù)，簡稱凍干，就是將含有水分的物質(zhì)，預(yù)先通過降溫凍結(jié)成固態(tài)，然后在真空低溫的條件下，通過對(duì)凍結(jié)物質(zhì)加熱使其中的水分直接升華和解吸出去，從而得到干物質(zhì)的技術(shù)[1-3]。冷凍干燥法，由于在低溫下進(jìn)行，物質(zhì)的理化活性能得到有效保護(hù)，干燥后的物質(zhì)疏松多孔，復(fù)水后能迅速恢復(fù)原來的狀態(tài)，且凍干過程能排除95%～99%的水分，使干燥后的物質(zhì)可以在室溫下長時(shí)間保存，大大減少了儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)牟槐鉡1-3]。因此，冷凍干燥技術(shù)廣泛用于保存熱敏性生物樣品，如蛋白質(zhì)、疫苗及微生物等。

冷凍干燥過程包括預(yù)凍、升華干燥和解吸干燥三個(gè)階段。預(yù)凍是為了在低溫下將物料中游離態(tài)的水凍結(jié)成冰，以利于水分的升華，是干燥的準(zhǔn)備階段。盡管如此，預(yù)凍卻是整個(gè)凍干過程中最為關(guān)鍵的一步，因?yàn)楸г陬A(yù)凍過程中形成，且預(yù)凍過程中的諸多因素不僅影響冰晶大小和形狀，而且影響后續(xù)的升華干燥速率以及凍干產(chǎn)品質(zhì)量[4,5]。例如，慢速冷凍時(shí)，形成的冰晶尺寸較大，凍干產(chǎn)品的孔徑較大，升華阻力也較小；快速冷凍時(shí)，形成較多細(xì)小的冰晶，導(dǎo)致冰晶表面積增大，使升華阻力增大。

用于物質(zhì)凍結(jié)特性和微觀結(jié)構(gòu)研究的最常用的方法是差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)和顯微鏡觀察法。根據(jù)DSC和顯微鏡的工作原理和特點(diǎn)，將其與冷凍干燥設(shè)備的功能有機(jī)結(jié)合，研制了一種連用DSC與顯微鏡觀察的冷凍干燥系統(tǒng)，并利用此系統(tǒng)，選擇保護(hù)劑海藻糖(trehalose, TR)和聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)，對(duì)TR/PVA水溶液進(jìn)行冷凍干燥實(shí)驗(yàn)，考察在不同冷凍速率和冷凍溶液用量等條件下對(duì)溶液凍結(jié)特性和升華過程的影響。

1 實(shí)驗(yàn)儀器、材料和方法

1.1 冷凍干燥系統(tǒng)

圖1 冷凍干燥系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic of freeze-drying system

如圖1所示，該冷凍干燥系統(tǒng)主要由冷凍系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、DSC熱分析系統(tǒng)、顯微攝像系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)組成。其中，冷凍系統(tǒng)包括凍干室、加熱元件和制冷元件，凍干室為一密閉容器，容器壁上設(shè)有透明部分，加熱元件和制冷元件設(shè)于凍干室上；凍干室連接真空系統(tǒng)；DSC熱分析系統(tǒng)設(shè)于凍干室內(nèi)部(未圖示)；顯微攝像系統(tǒng)設(shè)于凍干室外部，可透過凍干室蓋上的透明部分觀察內(nèi)部樣品的微觀結(jié)構(gòu)；DSC熱分析系統(tǒng)和顯微攝像系統(tǒng)分別與計(jì)算機(jī)連接[6]。制冷元件包括傳熱棒和液氮，凍干室的底部與傳熱棒一端連接，傳熱棒的另一端浸入液氮中，從而將冷量傳至凍干室，并以此對(duì)凍干室內(nèi)樣品進(jìn)行降溫和冷凍。液氮設(shè)于升降臺(tái)上。傳熱棒浸入液氮中的深度可以通過升降臺(tái)自由調(diào)節(jié)。上面所述的加熱元件包括電加熱絲和溫控器，電加熱絲均勻安裝在凍干室容器外表面，通過溫控器根據(jù)設(shè)定的溫度程序來調(diào)節(jié)加熱功率，為凍干室內(nèi)樣品提供熱源。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

選擇海藻糖(AR, Sigma)和聚乙烯醇(Mw=68000, Sigma)，配制一定濃度的TR/PVA混合水溶液，使海藻糖(TR)的質(zhì)量濃度為10%，聚乙烯醇(PVA)的質(zhì)量濃度為1%。分別取0.3mL和1.5mL的TR/PVA溶液裝入生物凍存管中，置于冷凍干燥系統(tǒng)的凍干室中進(jìn)行冷凍干燥實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DSC校準(zhǔn)

對(duì)冷凍干燥系統(tǒng)的DSC測量，采用超純水對(duì)熔點(diǎn)Tm(℃) 和結(jié)晶潛熱ΔHf(334J/K) 進(jìn)行兩點(diǎn)校準(zhǔn)，降溫速率為1℃/min，升溫速率為0.02℃/min，校準(zhǔn)方法如文獻(xiàn)[7]所述。

1.3.2 冷凍干燥實(shí)驗(yàn)

1) 預(yù)凍過程。將裝有TR/PVA溶液的凍存管放入冷凍干燥系統(tǒng)的凍干室中進(jìn)行預(yù)凍實(shí)驗(yàn)。首先將溶液在20℃恒溫保持約10min以除去熱歷史，然后分別采用以下2種冷凍方案進(jìn)行預(yù)凍，即:以1℃/min冷凍至-40℃并保持約1h(慢速)；直接投入液氮中，冷凍速率約為280℃/min，然后轉(zhuǎn)移至-40℃凍干室中放置約1h (快速)。

2) 冷凍干燥。將通過上述冷凍方案凍結(jié)的TR/PVA溶液置于-40℃凍干室中，待穩(wěn)定后開始抽真空使其升華干燥，升華溫度為-10℃，升華時(shí)間不少于20h，升華結(jié)束后在20℃進(jìn)行解吸干燥。

1.3.3 凍干溶液檢測

1) 凍干溶液顯微鏡觀察 采用Nikon倒置生物顯微鏡觀察凍干溶液的表面和截面，并利用Image Pro 6.0圖像分析軟件測量并計(jì)算凍干溶液的孔徑，計(jì)為預(yù)凍結(jié)束后凍結(jié)溶液中的冰晶尺寸。

2) 凍干溶液孔隙率測定 從凍干溶液上剪取一塊，測量其厚度，計(jì)算其體積為V，質(zhì)量為W1，將其浸入無水乙醇中至完全飽和，取出稱其質(zhì)量為W2，無水乙醇的密度極為ρ，那么凍干溶液的孔隙率 P = [(W2-W1)/ρ]/V。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論分析

2.1 冷凍條件對(duì)溶液凍結(jié)特性的影響

經(jīng)不同預(yù)凍方案的TR/PVA凍結(jié)溶液在升溫過程中的DSC曲線如圖2所示。從圖中可以看出，加快冷凍速率，并不影響凍結(jié)溶液的熔融溫度，但是凍結(jié)溶液的熔融峰面積卻因冷凍速率的加快而下降(表1)，這表明在先前的預(yù)凍過程中，加快冷凍速率，使溶液凍結(jié)不完全，使凍結(jié)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即凍結(jié)水占溶液中總含水量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降。凍結(jié)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以通過式(1)進(jìn)行估算:

圖2 不同冷凍方案所得TR/PVA凍結(jié)溶液的升溫DSC曲線Fig.2 DSC thawing curves of the frozen TR/PVA aqueous solution obtained from different freezing protocols

表1 冷凍速率對(duì)TR/PVA溶液凍結(jié)特性的影響Tab.1 Effects of cooling rate on the freeze parameters of the TR/PVA aqueous solution

2.2 冷凍條件對(duì)凍干溶液結(jié)構(gòu)的影響

冷凍條件對(duì)TR/PVA凍干溶液的結(jié)構(gòu)和形貌的影響，如圖3所示。其中，(A, a)是用量為0.3mL、通過慢速冷凍方案所得凍干溶液的上表面和斷面的顯微鏡照片，(B,b)是用量為1.5mL、通過慢速冷凍方案所得凍干溶液的上表面和斷面的顯微鏡照片，(C,c)是用量為0.3mL、通過慢速冷凍方案所得凍干溶液的上表面和斷面的顯微鏡照片。從圖中可以看出，經(jīng)冷凍干燥的TR/PVA凍干溶液內(nèi)部孔洞均勻，互相連通，這是在預(yù)凍階段形成的冰晶完全升華后留下的多孔通道。比較(A,a)和(C,c)可以看出，加快冷凍速率，所得凍干溶液的孔徑減小(表2)，網(wǎng)狀孔洞變得致密，盡管孔隙率受冷凍速率的影響很小 (表2)，這表明在先前的預(yù)凍過程中，加快冷凍速率使溶液過冷度增大，使成核點(diǎn)增多，且形成的細(xì)小冰晶來不及長大[8,9]，因此在凍干溶液中留下致密、尺寸很小的多孔通道。

眾所周知，在預(yù)凍階段，冷凍速率會(huì)影響溶液凍結(jié)時(shí)形成冰晶的尺寸，進(jìn)而影響凍干產(chǎn)品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，包括孔隙率和孔徑尺寸。在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)使用不同體積的TR/PVA溶液進(jìn)行冷凍干燥，所得凍干樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)會(huì)有所差異。如圖3(A,a)和(B,b)所示，采用相同的冷凍方案，冷凍速率都為1℃/min，屬于慢速冷凍，當(dāng)增加冷凍溶液的體積時(shí)，凍干溶液的孔徑尺寸卻隨之減小，孔洞也因而變得致密。這主要是因?yàn)樵谙惹暗念A(yù)凍過程中，增加冷凍溶液的體積，使溶液的過冷度增大，導(dǎo)致成核點(diǎn)增多，使冰晶尺寸減小，從而使凍干溶液的孔徑尺寸下降。

圖3 不同冷凍條件所得TR/PVA凍干溶液的表面(A-C)及斷面(a-c)顯微鏡照片F(xiàn)ig.3 Microphotos of the surface (A-C) and cross-section(a-c) of the freeze-dryed TR/PVA solution obtained from different freezing conditions

表2 冷凍速率對(duì)TR/PVA凍干溶液結(jié)構(gòu)的影響Tab.2 Effects of cooling rate on the texture of the freezingdryed TR/PVA solution

2.3 冷凍條件對(duì)升華率的影響

冷凍條件不同，溶液凍結(jié)形成冰晶尺寸就不同，后續(xù)的升華速率也會(huì)不同。盡管冰晶尺寸與升華率的關(guān)系還沒有測量到，但是根據(jù)努森分子擴(kuò)散理論[1]可以初步判斷，加快冷凍速率和增大冷凍溶液體積，會(huì)使冰晶尺寸減小，導(dǎo)致升華阻力增大。在實(shí)驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)，采用相同的升華干燥時(shí)間，即升華20h后，只有用量為0.3mL、采用慢速冷凍所得的凍結(jié)TR/PVA溶液才可以升華完全。繼續(xù)升華10h后，用量為0.3mL、采用快速冷凍所得的凍結(jié)TR/PVA溶液也可以升華完全。而用量為1.5mL的TR/PVA溶液，無論采用快速冷凍還是慢速冷凍，升華總時(shí)間長達(dá)30h后也未能升華完全。因此，為了提高升華率，優(yōu)化冷凍條件，選擇合適的冷凍速率和冷凍體積是非常有必要的，以便將冰晶尺寸控制在一個(gè)合適的范圍。

升華干燥結(jié)束后，還需要進(jìn)行解吸干燥以去除物料中非冷凍水。冰晶升華后留下的多孔通道對(duì)解吸干燥速率也有較大的影響。因此，優(yōu)化選擇冷凍條件時(shí)，只考慮升華速率是不夠的，還必須考慮對(duì)解吸干燥的影響。

3 總 結(jié)

通過研制的連用DSC與顯微方法的冷凍干燥系統(tǒng)，對(duì)保護(hù)劑海藻糖和聚乙烯醇(TR/PVA)水溶液進(jìn)行冷凍干燥實(shí)驗(yàn)，考察了冷凍速率和冷凍溶液的用量等冷凍條件對(duì)溶液凍結(jié)特性和升華干燥過程的影響。溶液凍結(jié)后形成的冰晶在升華干燥結(jié)束后留下多孔通道，因此可以利用顯微鏡研究多孔凍干溶液的微觀形貌，以判斷溶液凍結(jié)后冰晶的形成情況。冰晶的大小不僅受冷凍速率的影響，而且與溶液體積有關(guān)，加快冷凍速率會(huì)導(dǎo)致不完全冷凍并形成大量細(xì)小的冰晶，增加溶液體積也會(huì)引起過冷度增大，使冰晶尺寸減小，導(dǎo)致升華阻力增大，使升華速率減慢。

本文受中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開放基金(KF200919)項(xiàng)目資助。(The project was supported by the Opening Fund of Laboratory, Sun Yat-sen University (No. KF200919).)

[1] Hottot A, Vessot S, Andrieu J. Freeze drying of pharmaceuticals in vials: Influence of freezing protocol and sample configuration on ice morphology and freezedryed cake texuture [J]. Chem. Eng. Process., 2007, 46:666-674.

[2] Hottot A, Vessot S and Andrieu J. A direct characterization method of the ice morphology: Relationship between mean crystals size and primary drying times of freezedrying processes [J]. Drying Technol., 2004, 22(8):2009-2021.

[3] Passot S, Trelea I C, Marin M, et al. Effect of controlled ice nucleation on primary drying stage and protein recovery in vials cooled in a modified freeze-drying [J]. J.Biomech. Eng., 2009, 131: 074511-074515.

[4] 李云飛, 華澤釗, 傅行軍. 降溫速率對(duì)食品材料凍干特性的影響[J]. 制冷學(xué)報(bào), 2002, 4: 10-12. (Li Yunfei, Hua Zezhao, Fu Xingjun. The effects of freezing rates on the sublimation of foods [J]. Journal of Refrigeration, 2002, 4:10-12.)

[5] 蘇樹強(qiáng), 丁志華, 肖洪海, 等. 溶液類樣品凍干過程中隔板預(yù)凍特性分析[J]. 低溫工程, 2004,1:39-43.(Su Shuqiang, Ding Zhihua, Xiao Honghai, et al. Study on the solution freezing on the cooling shelf during lyophilization[J]. Cryogenics, 2004, 1: 39-43.)

[6] 王海燕, 呂樹申, 倫照榮. 具有DSC及微結(jié)構(gòu)觀察功能的真空冷凍干燥裝置. 中國, ZL201020155579.6 [P].2010-10-27. (Wang Haiyan, Lv Shushen, Lun Zhaorong.A freeze-drying experimental system coupled by DSC and Microscopy. China, ZL201020155579.6 [P]. 2010-10-27.)

[7] 王海燕, 呂樹申. 一種可視化DSC裝置的設(shè)計(jì)與校準(zhǔn)[J].工程熱物理學(xué)報(bào), 2010, 31(4): 682-684. (Wang Haiyan,Lv Shushen. Design and calibration of an optical DSC system [J]. Journal of Engineering Thermophysics, 2010,31(4): 682-684.)

[8] Wang H Y, Inada T, Funakoshi K, et al. Inhibition of nucleation and growth of ice by poly(vinyl alcohol) in vitrification solution [J]. Cryobiology, 2009, 59:83-89.

[9] Wang H Y, Lv S S, Lun Z R. Glass transition behavior of the vitrification solutions containing propanediol, dimethyl sulfoxide and polyvinyl alcohol [J]. Cryobiology, 2009,58(1): 115-117.