木聚糖酶產生菌的篩選鑒定及木聚糖酶基因（Xyn B）的克隆

廣西人口和計劃生育研究中心 莫 毅梁方方＊ 賴志強 盧玉發 廖玉英

廣 西 畜 牧 研 究 所 何仁春 黃麗霞

華南農業大學動物科學學院 楊 琳

木聚糖是一種由β-1，4-木糖苷鍵連接形成并帶有多種取代基的多聚糖，主要存在于植物細胞壁中，在自然界中是除纖維素之外第二豐富的可再生物質資源（Prade，1995）。植物性飼料中含有大量木聚糖，它們在動物消化道內，不易被消化酶消化，從而增加了動物消化道內的食糜黏性，降低飼料消化率和營養的吸收（張曉暉等，2007）。微生物木聚糖酶能水解木聚糖生成長度各異的木寡糖，對半纖維素降解起著關鍵作用，其中以內切方式降解木聚糖分子中1，4-β-D木糖苷鍵的O-糖苷水解酶（O-glycoside hydrolases）為主，其水解產物主要為木糖、木二糖及木三糖等低聚木糖，還有少量阿拉伯糖（徐君飛等，2007）。研究表明，木聚糖酶可改善消化道功能、增強免疫力、提高飼料利用率和生產性能、減少糞便對環境的污染（楊會濤等，2007）。

為了獲得酶活性較高的木聚糖酶產生菌，本試驗從長期堆放青貯飼料堆下土壤中取樣，并通過木聚糖富集培養基和篩選培養基分級篩選出一株產木聚糖酶活性較高的菌株，對其進行了細菌形態學鑒定、16 S rRNA PCR擴增鑒定；而后使用Oligo 6.44生物軟件，根據上述鑒定結果，以Genebank中公布的木聚糖酶Xyn B基因序列為模板，設計特異引物擴增其Xyn B基因，為日后木聚糖酶Xyn B基因的重組高效表達和在動物飼料添加劑中應用提供材料。

1 材料與方法

1.1 土樣 土壤樣品取自廣西畜牧研究所黃牛室長期堆放青貯飼料堆下，采集富含腐敗木質纖維材料的土壤樣品若干份。采集時用小鏟子除去表土后離地面5～15 cm處取樣，盛于事先滅菌帶塞子的試管中。

1.2 酶和主要試劑 Taq DNA聚合酶，dNTPs和DNA分子量標準購自TaKaRa公司，木聚糖購自Sigma公司，其他常規試劑為國產分析純。

1.3 培養基

1.3.1 富集培養基（g/L）木聚糖 10，蛋白胨 5，氯化鈉 5，pH自然，121℃滅菌20 min（陳勇等，2009）。

1.3.2 平板篩選培養基（g/L）木聚糖10，硝酸鉀l，硫酸鎂 0.2，氯化鈉 0.5，磷酸氫二鉀 0.5，瓊脂20，pH 自然，121 ℃滅菌 20 min（陳勇等，2009）。

1.3.3 斜面培養基（g/L）木聚糖8，酵母膏5，硫酸鎂0.2，氯化鈉0.5，磷酸氫二鉀0.5，硫酸錳0.005，瓊脂 20。pH 自然，121℃滅菌 20 min（陳勇等，2009）。

1.4 方法 采取土樣→無菌水浸提 （取上清液）→富集培養→取上清液涂布平板篩選培養基→分離純化→透明圈大的菌株為優良菌株→16S rRNA鑒定→木聚糖酶XynB基因克隆。

1.5 菌種的富集、分離、篩選和純化 稱取1 g土壤樣品放入l00 mL無菌PBS的三角瓶中，放入搖床，37℃，200 r/min振蕩，將土樣搖散后培養1 h。取出靜置，按無菌操作要求取1 mL上清液接入富集培養基中，37℃，200 r/min振蕩培養24 h。將經過富集的菌液取出離心，依次稀釋成10-6，10-7，10-8倍，取菌液0.2 mL涂布于平板篩選培養基上，放入37℃恒溫培養箱，倒置培養48 h。挑選透明圈較大的單菌落，轉接到新鮮的分離平板進行反復純化。配制斜面培養基，將純化的菌種接種到斜面培養基上，測量透明圈的直徑，所有數據是重復3次的平均值。然后，選定透明圈最大且透明的菌株作為后續試驗的基礎菌。

1.6 菌種形態學特征鑒定 參照Dong和Cai（2001）通過革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體形態。

1.7 16S rRNA鑒定 本試驗采用細菌16S rRNA通用引物進行PCR擴增，引物序列如下（由上海生工生物工程技術服務有限公司合成）：

16SrRNAF：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇

16SrRNAR：5＇-GGTTACCTIGTTACGACTT-3＇

挑取少許培養24 h的斜面菌種，加入1.0 mL無菌水中制成菌懸液，作為PCR反應的模板，PTC-200 PCR儀（美國MJ公司）進行PCR擴增。PCR 反應體系為 50 μL， 含有模板 2.0 μL，10 mmol/L 正 反 引 物 各 1.5 μL，10 mmol/L dNTPs 1.5 μL，10×Reactions Buffer 5.0 μL，2 U rTaq 酶，ddH2O補足 50 μL。反應條件：95℃預變性 5 min，94℃變性 45 s，53.5℃退火 50 s，72℃延伸90 s，34個循環；72℃后延伸 10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測見圖1，并送于上海鼎安生物工程技術服務有限公司進行測序。將所得測序結果通過Blast程序與Genebank中核酸數據進行比對分析（Naveen等，2000）。

1.8 木聚糖酶Xyn B基因克隆 根據形態學特征和16S rRNA鑒定結果，從Genebank中調取枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis strain）的木聚糖酶Xyn B基因的cDNA序列，并以此為模板，使用Oligo 6.44軟件設計其特異引物，引物序列如下：

Xyn B F：5＇ -GAATTCCATCATATGTTTAAGTTTAAAAAGAAT-3＇

XynB R：5＇-TCTAGATGATGCCACACTGTTTTAGAAC-3＇（刪除TAA終止子密碼）

使用與16s rRNA類似的PCR程序，只是退火溫度改為45℃，進行木聚糖酶Xyn B基因的擴增見圖1。PCR產物經純化后，回收片段與pUC18-T vector連接過夜后，連接反應液轉化E coli DH5α（曾靜等，2002）；在含氨芐青霉素的 LB選擇培養基中，挑取白色菌落，篩選陽性克隆，經PCR檢測后，送于上海鼎安生物工程技術服務有限公司進行測序。將所得序列通過Blast程序與Genbank中核酸數據進行比對分析 （Naveen等，2000）。

2 結果分析和討論

2.1 木聚糖酶高產菌株的篩選 將采集的土壤經富集培養及大量平板劃線培養分離，得到比較單一的菌落，此過程得到7株較純菌株。將這些菌株分別接種到斜面培養基，每株點3個重復，37℃培養后測量透明圈的直徑，所有數據是重復3次的平均值。分離到的7株菌的形態特征，及其透明圈測量結果見表1。根據透明圈的大小在一定程度上反應了菌株產酶能力的強弱。挑選其中透明圈較大且透明的菌株轉接于斜面培養基，并用封口膜封存置于4℃冰箱內保存。選擇產生透明圈最大的菌株X7，作為后續試驗的基礎菌。

表1 木聚糖酶產生菌株的形態特征及透明圈測量結果

2.2 菌株形態特征鑒定 菌株X7革蘭氏染色反應為陽性；呈桿狀，無莢膜，周生鞭毛；形成芽孢，呈橢圓到柱形，芽孢生長時菌體會稍微增大；在斜面培養基平板上生長較快，呈淡黃色菌落，表面粗糙不透明。

2.3 16S rRNA序列分析鑒定 使用16S rRNA通用引物從菌株基因組中擴增出約1.5 kb的目的片段，PCR產物交由上海鼎安生物工程技術服務有限公司進行測序，測序結果與GeneBank中的序列進行比對，結果表明，菌株X7與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis strain GD3b，Genebank 編碼HM055602.1）同源性最高為98.5%，與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）庫中其他記錄的16S rRNA均有90%以上的同源性。結合菌株形態特征鑒定和16S rRNA序列分析鑒定，故該菌株X7應隸屬于枯草芽孢桿菌屬。

2.4 木聚糖酶Xyn B基因克隆及序列分析 使用枯草芽孢桿菌Xyn B基因特異引物從菌株X7基因組中擴增出約0.6 kb的目的片段，PCR產物經瓊脂糖凝膠純化后，與pUC18-T vector連接獲得陽性克隆pUC-Xyn B，挑選陽性克隆交由上海鼎安生物工程技術服務有限公司進行測序，測序結果使用GeneBank中Blast程序進行序列比對，結果表明：pUC-Xyn B測序結果與GeneBank中公布枯草芽孢桿菌的Xyn B基因序列同源性為99.0%，克隆子484位和499位核苷酸堿基發生突變，分別為（A）CG-（T）CG，AC（T）-AC（C）；相應的氨基酸突變前者為錯義突變T-S，后者為同義突變T-T。

3 結論

本研究中成功篩選到了7株木聚糖酶產生菌，并選取透明圈最大的木聚糖酶產生菌X7作為基礎菌，對其進行16 s rRNA部分序列PCR擴增測定，經BLAST同源性分析確定X7為枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis strain GD3b（Genebank 編碼：HM055602.1）。然后，從 GeneBank中獲取枯草芽孢桿菌Xyn B基因序列，設計特異引物從X7菌株中克隆相應的目的基因。為日后構建木聚糖酶Xyn B基因酵母表達載體，培育能夠分泌表達具有高活性的木聚糖酶酵母工程菌奠定了基礎。

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