癌胚抗原化學發光免疫定量分析方法的建立

馮艷銘，夏曉燕，潘新娟，宋 琳

癌胚抗原(CEA)為最常用的腫瘤標志物之一，癌胚抗原最初發現于成人結腸癌組織中，1965 年由Gold 首先報道。CEA 是一種結構復雜的可溶性糖蛋白，分子量約為200 000，胚胎期主要存在于胎兒的胃腸管、胰腺和肝臟，出生后組織內含量很低;胃腸道惡性腫瘤時可見血清CEA 升高，在乳腺癌肺癌及其他惡性腫瘤患者的血清中也有升高;因此，CEA 是一種廣譜腫瘤標志物，雖然不能作為診斷某種惡性腫瘤的特異性指標，但在惡性腫瘤的鑒別診斷、病情監測、療效評價等方面，仍有重要臨床價值。血清CEA 升高主要見于結腸直腸癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等，其他惡性腫瘤也有不同程度的高表達。CEA 連續隨訪檢測，可用于惡性腫瘤手術后的療效觀察及預后判斷，也可用于對化療病人的療效評價。一般情況下，病情好轉時血清CEA 濃度下降，病情惡化時升高。腸道憩室炎、直腸息肉、結腸炎、肝硬化、肝炎和肺部疾病也有不同程度的升高，但陽性的百分率較低。另外，98%的非吸煙健康人血清CEA ＜5 μg/L，吸煙者中約有3.9%的人CEA＞5 μg/L。正常人血清CEA 含量在0 ～5 μg/L 之間，CEA 正常值一般低于5 μg/L。本文根據化學發光免疫分析法的原理建立并研制了癌胚抗原化學發光定量測定試劑盒［1］，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 抗CEA 單抗腹水購自OEM公司;CEA 多克隆抗體為自制;CEA 純品抗原購自Fitzgeral 公司;堿性磷酸酶(ALP)由華美生物工程公司提供;化學發光底物CSPD及增強劑SapphireII 購自PE 公司;過碘酸鈉(NaIO4)、硼氫化鈉(NaBH4)、乙二醇、2，4－二硝基氟苯(DNFB)均購自Sigma 公司;Sephadex G－200 凝膠柱層析購自LKB 公司，DE－52 離子交換柱購自Sigma 公司，聚苯乙烯塑料白色不透明微孔板購自深圳金燦華;Luminescent 化學發光儀(芬蘭雷勃);洗板機(Bio-Rad);CEA 國家標準品購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 標本來源 標本均為血清，清亮無溶血，－20℃凍存。分別為健康體檢門診的成年男性200份，成年女性(非妊娠女性)200 份，青少年200 份，老年人標本200 份，其中男女比例為1∶1;臨床標本100 份為陜西省人民醫院放免科采集的腫瘤或疑似患者血清。

1.3 方法

1.3.1 CEA 單克隆抗體的純化 抗CEA 單抗腹水用500 g/L 的飽和硫酸銨沉淀，再溶解透析后DE－52 換柱純化，分部收集，測定蛋白濃度。蛋白濃度應在4 ～10 g/L 之間，無菌過濾，加1g/L NaN3后分裝，－20℃存放。

1.3.2 CEA 多抗血清制備與純化 純品CEA 免疫健康雄性山羊，首次劑量0.5 mg/只。4 周后加強免疫，劑量減半，共加強免疫3 次。耳靜脈采血測定效價，雙擴散效價＞1∶128 的羊，進行心臟采血，分離血清，羊抗CEA 血清按照1.3.1 方法進行純化。

1.3.3 堿性磷酸酶標記抗體的制備 采用改良過碘酸鈉－乙二醇法［2，3］進行標記，將獲得的IgG-ALP用含100 g/L 小牛血清的0.05 mol/L (pH7.6)TBS緩沖液按1∶1000 稀釋成工作液，保存于－20℃。

1.3.4 CEA 校準品制備 用系列國家標準品標定CEA 純品抗原后，用CEA 校準品稀釋液稀釋成含量分別為0、2.5、10、40、160、640 ng/mL 系列濃度，用國家標準品做定量曲線進行校準品濃度測定、相關性分析，建立定量標準品。

1.3.5 化學發光系統的優化 由不同濃度的SapphireII 增強劑和CSPD 組成底物工作液，進行化學發光值(RLU)測定，進行底物工作液的優化。

1.3.6 固相化抗體微孔板的制備 將抗CEA 單抗用0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋成2.0、5.0、8. 0、10. 0、13. 0、15. 0 μg/mL 的包被濃度，按100 μL/孔的量加入包被板中，37℃包被2 h，再用含1%酪蛋白的0.01 mol/L PBS(pH7.4)37℃封閉2 h后晾干備用［4］，確定包被選擇最佳包被抗體工作濃度。

1.3.7 正常人參考血清的確定 用優化好的CEA化學發光定量試劑對800 份健康人標本進行濃度測定，進行統計學分析，計算+1.64s，確定血清醫學參考值范圍。

1.3.8 化學發光免疫檢測 樣品或標準品于相應孔分別加25 μL 后，每孔再各加抗CEA-ALP 75 μL，在振蕩器上混勻1 min，置37℃恒溫反應60 min。洗掉游離成分，加入底物工作液50 μL，ALP 催化底物脫磷酸酯，并發出463 nm 的可見光，第10 分鐘后測定各加樣品孔的發光值RLU，并將數據用化學發光檢測儀定量軟件Luminoskan ascent version 2.4.1 進行定量分析。

2 結果

2.1 底物工作液的優化 CSPD 濃度為0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mmol/L，SapphireII 濃度為2.0、1.5、1.0、0.5、0.25 g/L，用堿性磷酸酶1∶1 000 在10 min 進行化學發光測定，記錄不同增強劑和CSPD 濃度的發光值，分別做出CSPD 濃度－RLU 的曲線和SapphireIIRLU 的曲線(圖1、2)。分析上述數據可得出以下結論:CSPD 在0.4 mmol/L 以下時，RLU 隨CSPD 濃度的變化而成比例變化，在0.4 mmol/L 時達到平臺，可能是底物濃度在0.4 mmol/L 時使酶達到飽和。增強劑SapphireII 濃度對RLU 的變化，在1.5 g/L 時達到最大RLU，隨著增強劑濃度的增加RLU 達到平臺期，確定底物工作液配制的濃度為:0.4 mmol/L 的CSPD，增強劑SapphireII 濃度為1.5 g/L。

圖1 不同濃度的增強劑SapphireII 的RLU 的曲線

圖2 不同濃度的底物CSPD 的RLU 的曲線

2.2 包被抗體濃度和酶標記抗體濃度的確定 根據不同包被抗體濃度測定定量標準品的發光值，分別做出不同濃度包被抗體－RLU 的曲線(圖3)。包被濃度低時試劑的整體發光值也低，隨著包被濃度的升高發光值也相應升高，在10 μg/mL 時，發光值達到一個平臺期(此時靈敏度達到一個平臺期)，選擇標準曲線接近于直線時的包被濃度(10 μg/mL)為最佳。

圖3 不同包被濃度對定量標準品RLU 的變化曲線

2.3 最低檢出量 平行測定20 孔零值校準品血清，計算零值校準品RLU 平均值(x)及標準差(s)，以+2s 為測定值代入標準曲線方程中，求出其對應的濃度值，所對應的濃度值即為最低檢出量為0.5 ng/mL。

2.4 特異性檢測 分別測定與AFP(3 μg/mL)、鐵蛋白(10 μg/mL)、人血清蛋白(200 g/L)、人丙種球蛋白(200 g/L)的交叉反應率，分別為≤0.015%、≤0.034%、≤4.5 ×10－8、≤5.0 ×10－8。

2.5 精密度 測定CEA 濃度為48.8 ～73.2 ng/mL的質控血清，重復檢測3 次，每次重復20 孔，進行精密度測定，計算批內、批間平均變異系數分別為8.6%、7.5%。

2.6 正常人血清CEA 醫學參考值的確定 對800份健康人血清檢測進行統計，其中有96.1%的健康人血清小于5.0 μg/L，參考值范圍為單側只有上限而無下限，按照95% 單側上限參考值范圍為+1.64s，同時參考放免檢測結果和目前公認的正常值范圍，本檢測方法的正常人血清應小于5.0 μg/L。

2.7 準確度 取3 份臨床樣本分別加入5 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL 濃度的血清樣品測試樣品的加入回收率，對3 份臨床樣本分別進行90%、60%、30%稀釋計算稀釋回收率，結果顯示:加入平均回收率為97.4%，平均稀釋回收率為101.8%。

2.8 與進口試劑的比較 與Bayer ACS:180全自動化學發光系統的CEA 試劑共同對100 份臨床標本進行檢測，二者所得的數值進行分析，其相關性有統計學意義(見圖4)，LumiassayTM=0.95 ×ACS:180+0.7789(n=100)，(r=0.968，P ＜0.001)。

圖4 化學發光免疫測定試劑

3 討論

化學發光免疫分析方法作為一種高選擇、高靈敏度檢測方法被廣泛應用在臨床檢測和藥物分析［5］。根據發光體系應用于免疫分析中的方式不同［6］，可分為:直接標記發光物質的免疫技術、酶催化化學發光免疫分析、電化學發光免疫分析3 種。本研究采用酶催化法，以酶標記抗體或抗原等生物活性物質，酶的底物是發光劑，免疫反應復合物的酶作用于底物，產生光信號，測定發光信號的強度。癌胚抗原(CEA)為最常用的腫瘤標志物之一，其定量檢測的方法主要有放射免疫法、酶聯免疫法、時間分辨熒光免疫法和化學發光免疫法，各具特點。

本研究建立的癌胚抗原(CEA)化學發光免疫定量分析方法，采用自行設計CEA 多抗血清制備和純化工藝，采用改良過碘酸鈉－乙二醇法對CEA 多抗進行ALP 標記，較傳統的戊二醛交聯法標記效率要高，靈敏度、特異性都較好;采用金剛烷衍生物及其增強劑作為發光底物系統［7］，其酶解速度快，達到最大光信號時間短，且發光信號強、持續時間長，信噪比高，通過優化增強劑的濃度能使發光強度增強102～105倍;可測定濃度線性范圍寬，樣品無需稀釋即可檢測。由于化學發光具有熒光的特異性，同時不需要激發光，從而避免了熒光分析中激發光雜散光的影響，有很高的靈敏度，該方法最低檢出量為0.5 ng/mL。與Zhuang［7］等合成一種新型雙吖啶化合物DMDSBA 用于標記抗－CEA 抗體建立了一種新的夾心化學發光免疫方法，測定人血清中CEA 的線性范圍為1.0 ～100 ng/mL、檢測限為0.53 ng/mL 是一致的。該方法克服了傳統的放射免疫法帶來的環境污染和健康危害，操作簡單，檢測自動化程度高，其敏感性、特異性、線性范圍、精密度、回收率均能滿足常規臨床檢測要求，并采用開放式反應系統，因此可與大多數的化學發光檢測儀器配套使用，適宜在臨床推廣應用。

［1］賀艷峰，張家明，郭小英，等. 化學發光法檢測腫瘤標志物［J］.化學通報，2005，68:135－146.

［2］馮艷銘，馬俊芬，吳飚，等.甲胎蛋白化學發光免疫定量分析方法的建立［J］. 第四軍醫大學學報，2007，28(14):1291－1293.

［3］Lin J，Yan F，Hu X，et al.Chemiluminescent immunosensor for CA19－9 based on antigen immobilization on a cross-linked chitosan membrane［J］.Immunol Method，2004，291(1－2):165－174.

［4］Chen D，Kaplan LA.Performance of a new-generation chemiluminescent assay for hepatitis B surface antigen［J］.Clin Chem，2006，52:1592－1598.

［5］尹東光，賀佑豐，劉一兵，等.幾種主要化學發光物質的發光性能及其化學發光免疫分析體系［J］. 標記免疫分析與臨床，2002，9(4):225－229.

［6］Jie hua LIN，Wei QU，Shusheng ZHANG. Electrochemical immunosensor for carcinoembryonic antigen based on antigen immobilization in gold nanoparticles modified chitosan membrane［J］.Anal Sci，2007，23(9):1059－1063.

［7］Hui-sheng Zhuang，Jin-ling Huang，Guonan Chen. Synthesis of a new biacridine and its using as the chemiluminescent probe for immunoassay of carcinoembryonic antigen［J］. Anal Chim Acta，2004，512(2):347－353.