海帶熱休克蛋白70基因體外原核表達研究

付萬冬 ，姚建亭 ，段德麟

（1.浙江省海洋開發研究院，浙江舟山 316100；2.中國科學院海洋研究所，山東青島 266071）

熱休克蛋白是一組在結構上高度保守的蛋白質，廣泛存在于原核和真核細胞中，正常情況下與應激條件下都發揮重要的生理功能，但在脅迫條件（包括熱激、物理、化學和生物等脅迫因子）下，HSPs表達量顯著增加。HSPs參與維持蛋白質空間構象，保護細胞生命活動，折疊和跨膜運輸新生的蛋白，修復錯誤折疊的蛋白，幫助降解變性的蛋白，穩定細胞骨架和核骨架、增加細胞的抵抗能力等功能。

HSP70是熱休克蛋白家族中重要成員，廣泛分布于細胞核、細胞質、內質網、線粒體和葉綠體等細胞的各個部分[1-3]。HSP70在生物對逆境的適應，對減輕逆境脅迫引起的傷害和幫助生物度過不良環境中起到很大的作用。作為分子伴侶參與所有細胞內蛋白質的從頭合成和定位、蛋白質的加工和錯誤折疊蛋白質的降解及其調節過程，因而在正常條件或脅迫條件下，對于細胞的功能和代謝都起到重要的作用[4-7]。

海帶是潮間帶典型的褐藻，有重要的經濟價值和生態價值。固著藻類隨潮汐變化，無法逃脫不利的生活環境，面臨嚴重的環境脅迫。因此，固著藻類必須有適當的生理生化改變以應對環境脅迫。到目前為止，已在一些藻類中開展了有關脅迫應激的研究[8-15]，但有關HSP70在海藻抗逆環境脅迫中的作用一直未得到深入了解，因此，開展研究海藻受脅迫后，HSP70在抗逆中的作用具有重要的理論意義和潛在的應用價值。在前期克隆得到海帶細胞質定位的HSP70基因全長cDNA序列基礎上[16-17]，將海帶HSP70基因的開放閱讀框區域克隆到表達載體，并轉化到原核表達系統，進行體外表達。以期為進一步研究藻類HSP70的生物學功能和海藻抗逆分子機制打下基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器試劑

1.1.1 材料處理

海帶cDNA由海帶總RNA為模板反轉錄合成，大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)pLysS由本實驗保存。

1.1.2 儀器和試劑

儀器：高壓滅菌鍋YXQ-LS-S（上海博訊實業有限公司醫療設備廠，上海）；電子天平AB104-N（梅特勒-托利多儀器有限公司，上海）；臺式冷凍離心機5417R、常溫高速離心機5415D、Mastercycler Gradient PCR儀（Eppendorf儀器公司，德國）；電泳儀及水平電泳槽（大連捷邁科貿有限公司，遼寧）；水平電泳槽AE-7300（ATTO儀器公司，日本）；ImageMaster VDS成像系統（Pharmacia Biotech，瑞典）；Millipore純水系統（Millipore公司，美國）；超低溫冰箱（三洋儀器公司，日本）；超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司，江蘇）。

試劑：Taq DNA 聚合酶（附帶 PCR buffer及 dNTPs）、RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0、PMD-18T（大連寶生物工程有限公司，中國）FastaGen小量膠回收試劑盒（飛捷生物技術有限公司，上海）；pEASY-E2 Expression Kit（北京全式金生物技術有限公司，北京）；LA Taq聚合酶（大連寶生物公司）；DNA Marker（天根生化科技有限公司，北京）；Nde I、Xho I內切酶（Promega公司，美國）；其他試劑均為國產分析純。

1.2 海帶HSP70基因ORF的克隆

1.2.1 擴增海帶HSP70 ORF引物的設計及合成

根據已克隆測序的海帶HSP70基因核酸序列（Genbank Accession number：FJ375359），設計特異性引物擴增海帶HSP70基因開放閱讀框，引物信息如下：上游引物LJHSP70-EF：5′-ATGACAGCCGTCGAGGGAGAGAGCG-3′；下游引物 LJHSP70-ER：5′-GTCGATCTCCTCGATCTTGGGCCCG-3′。上游引物起始于起始密碼子，下游引物終止于終止密碼子前（不包括終止密碼子）。從海帶總RNA反轉錄成的cDNA中PCR擴增出HSP70基因開放閱讀框，擴增產物為1 971 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司協助合成。

1.2.2 PCR 擴增海帶 HSP70 基因 ORF

根據設計的引物LJHSP70-EF和LJHSP70-ER從海帶cDNA中擴增HSP70 ORF。PCR反應體系的組成（共50 μL）：10×buffe（rMg2+，25 mM），5 μL；dNTP Mixture(10 mM each)，2 μL；Ex Taq聚合酶（2.5 U/μL），0.25 μl；海帶 cDNA，2 μL；引物（各 10 μM），2 μL；dH2O，36.75 μL。PCR 反應條件：預擴增 94 ℃，3 min；擴增反應35個循環；變性94℃，30 s；退火58℃，30 s；延伸72℃，2 min；最后延伸72℃，10 min。

1.3 HSP70表達質粒的構建和鑒定

1.3.1 pEASY-E2(+)/HSP70 表達質粒的構建

取PCR產物在1%瓊脂糖凝膠，100 V電泳30 min，在253 nm波長下觀察拍照。目的產物用Fastagen小量DNA膠回收試劑盒純化，按說明書所示方法進行。將純化的目的片段HSP70和pEASY-E2以體積比2:1混勻，在25℃下連接5 min。將連接好的重組質粒命名為pEASY-E2(+)/HSP70。BL21(DE3)感受態細胞的制備、pEASY-E2(+)/HSP70質粒的連接和轉化等步驟參照《分子克隆實驗指南》(第3版)。

1.3.2 pEASY-E2(+)/HSP70 表達質粒的鑒定

（1）PCR法鑒定正確表達方向的陽性重組子

挑選陽性克隆于10 μL無菌水中，渦旋混勻作為反應模板，15 μL PCR反應體系組成如下：2×Taq Mixer，7.5 μL；菌液，2 μL；LJHSP70-EF(10 μM)，1 μL；T7 terminator primer(10 μM)，1 μL；dH2O，3.5 μL。PCR反應條件：預擴增94℃，3 min；擴增反應35個循環；變性94℃，30 s；退火58℃，30 s；延伸72℃，2 min；最后延伸溫度72℃，10 min。取PCR產物在1%瓊脂糖凝膠，100 V電泳30 min，在253 nm波長下觀察拍照。陽性克隆重組子在2 000 bp左右會有1條電泳條帶。

（2）限制性酶切分析陽性重組子

挑選正確表達方向的陽性重組子過夜培養。用堿裂解法提取質粒，具體步驟參照《分子克隆實驗指南》（第3版）。對提取的重組質粒pEASY-E2(+)/HSP70，用Nde I和Xho I雙酶切，酶切反應于37℃條件下保溫3～4 h，使酶切反應完全。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定篩選的陽性克隆并照相。陽性克隆由上海生工生物工程技術服務有限公司進行克隆片段的DNA測序，測序結果與HSP70核酸序列進行比對。將含正確序列的陽性重組質粒的表達菌株BL21(DE3)命名為BL21(DE3)/pEASY-E2(+)/HSP70。

1.4 海帶HSP70的體外表達和電泳檢測

將重組菌BL21(DE3)/pEASY-E2(+)/HSP70接種于5 mL含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，于37℃振蕩過夜培養。次日分別取出1 mL菌液接入3瓶50 mL相同的培養基繼續培養2～3 h（OD600約0.6）后，加入終濃度分別為0 mM、1 mM和5 mM的IPTG誘導表達，于37℃振蕩培養不同時間，以BL21(DE3)/pEASY-E2(+)作為空白對照。每小時取出菌液1 mL，5 000×g離心10 min，收集菌體備用。

取上述不同時間階段的1 mL菌液離心得到的菌體加100 μL dH2O，分別與等體積的2×上樣緩沖液混合，100℃水浴5～8 min。上樣前8 000×g離心5 min。配制12%的SDSPAGE分離膠和5%的濃縮膠，取20 μL加樣于凝膠，在濃縮膠中20 mA，分離膠中40 mA進行SDS-PAGE（Laemmli,1970）恒流電泳，電泳結束后將凝膠用聚丙烯酰胺凝膠染色液，染色15 min。染色結束后用脫色液將聚丙烯酰胺凝膠背景顏色脫色干凈，此時蛋白質條帶可以清楚顯現出來。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增海帶HSP70的ORF

根據本研究得到海帶HSP70 cDNA序列信息，設計了表達海帶HSP70蛋白的引物，從海帶cDNA中擴增出1 970 bp左右的DNA片段（圖1），和預期要擴增的片段大小一致，是否目的片段還要進一步驗證以確定。

圖1 PCR擴增海帶HSP70 ORF結果Fig.1 The result of ORF fragment of L.japonica HSP70 of PCR amplication

2.2 HSP70表達質粒的鑒定

2.2.1 PCR 擴增鑒定陽性的重組子

將擴增得到的目的片段進行了膠回收，和PMD-18T載體進行連接，再轉化大腸桿菌DH5α，將陽性克隆送往上海生工生物工程有限公司測序。確定是擴增的目的片段后，將回收的目的片段和/pEASY-E2表達載體連接，再轉化表達菌株BL21(DE3)，挑選陽性克隆利用表達蛋白上游引物LJHSP70-EF和表達載體T7終止引物序列進行PCR擴增鑒定陽性的重組子。檢測結果如圖2所示。根據結果可知挑選2個陽性重組子插入方向正確，可以進行下步蛋白表達實驗。

圖2 PCR檢測陽性克隆的結果Fig.2 The result of detection of positive cloning fragment by PCR

2.2.2 限制性酶切分析陽性重組子

對提取的重組質粒pEASY-E2(+)/HSP70，用Nde I和Xho I雙酶切，結果表明陽性克隆的質粒能被兩種酶酶切成線性的質粒片段和目的片段（圖3）。

圖3 pEASY-E2(+)/HSP70表達質粒的Nde I和Xho I雙酶切圖譜Fig.3 Restriction patterns of plasmid pEASY-E2(+)/HSP70 digested with Nde I and Xho I

2.3 海帶HSP70基因體外表達

將構建好的表達質粒pEASY-E2(+)/HSP70轉化到大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)，挑選陽性重組子進行LB液體培養，當菌液的OD600約0.6時，加入終濃度分別為0 mM，1 mM和5mM的IPTG在37℃下培養誘導，以空載體pEASY-E2(+)重組子作為對照。每小時取樣1次，檢測外源蛋白的表達量。結果表明空載體重組子在SDS-PAGE圖譜上無72 kDa左右的蛋白條帶（圖4）；無IPTG誘導的陽性重組子在SDS-PAGE圖譜上在72 kDa左右有1條非常微弱條帶（圖5）；而陽性重組子在1 mM或5 mM的IPTG誘導下，SDS-PAGE圖譜上在72 kDa左右有1條明顯的條帶（圖6，圖7），這與海帶HSP70的預測分子量72.03 kDa的結果相符合，說明海帶HSP70基因在體外成功地獲得了表達。不同時間對海帶HSP70蛋白誘導表達結果表明，海帶HSP70蛋白的產生與體外誘導時間顯著相關，未誘導的培養液中幾乎沒有HSP70蛋白的產生。在1 mM或5 mM的IPTG誘導下，伴隨誘導時間的增長，HSP70蛋白的表達量顯著增加，當誘導5 h以后，基因的表達達到平臺，繼續培養，HSP70的表達并不顯著增高。本研究中，5mM的IPTG誘導外源蛋白HSP70的表達量要高于相應時刻1 mM的IPTG誘導外源蛋白HSP70的表達量。

圖4 不同培養時間下，BL21(DE3)/pEASY-E2(+)的SDS-PAGE分析Fig.4 Analysis of BL21(DE3)/pEASY-E2(+)by SDSPAGE in different cultured times

圖5 無IPTG，不同培養時間下，BL21(DE3)/pEASY-E2(+)/HSP70的SDS-PAGE分析Fig.5 Analysis of the E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2(+)/HSP70)by SDS-PAGE in different cultured times at IPTG concentration of 0 mM.Lane M:Protein Marker;

圖6 1 mM IPTG誘導不同時間后，BL21(DE3)/pEASYE2(+)/HSP70的SDS-PAGE分析Fig.6 Analysis of the E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2(+)/HSP70)by SDS-PAGE in different induced times at IPTG concentration of 1 mM.Lane M:Protein Marker;

圖7 5 mM IPTG，不同誘導時間，BL21(DE3)/pEASY-E2(+)/HSP70的SDS-PAGE分析Fig.7 Analysis of the E.coli BL21(DE3)/pEASY-E2(+)/HSP70)by SDS-PAGE in different induced times at IPTG concentration of 5 mM.Lane M:Protein Marker;

3 討論

重組子成功構建是實現基因體外表達的關鍵。根據海帶HSP70基因的蛋白序列分析，將編碼HSP70成熟肽的開放閱讀框序列克隆到pEASY-E2表達載體上并轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中。轉化子經PCR篩選、序列測定以及SDS-PAGE電泳等多重鑒定，結果顯示，HSP70基因的插入方向正確、序列結構完整、且基因片斷正確的插入到表達載體相應的位置，成功地構建了海帶HSP70基因的重組子。SDS-PAGE電泳分析顯示，與無插入片段的陰性對照相比，在預測大小區域內，有72 kDa蛋白插入，證明海帶HSP70重組蛋白獲得了表達。

重組蛋白的高效表達，是體外獲得大量重組蛋白的基礎。體外表達受多種因素影響，包括培養溫度，誘導時間，誘導劑量等。不同誘導時間對重組蛋白表達的影響實驗結果表明，經IPTG誘導，菌體很快就能產生重組蛋白，重組蛋白的產量隨誘導時間而增加。約5 h后，其表達量達到平臺期，過長時間的表達，重組蛋白的產量并沒有顯著增加。由于選擇質粒帶有氨卞青霉素的抗性，在重組蛋白的表達過程中，氨卞青霉素具有很強的選擇作用，保證了重組質粒的正常生長。但是，氨卞青霉素本身很不穩定，在細菌培養液中容易被降解，而失去對重組質粒的保護。因此在重組蛋白的表達過程中，縮短培養時間對保證重組蛋白的純度、預防污染，都有重要的意義。

重組蛋白的純化方法很多，包括葡聚糖層析、等電點分離、親和層析、透析等多種技術。一般地，為獲得較高純度的蛋白質，一般需要結合一種或幾種不同的純化技術共同進行。本研究選用的表達載體是pEASY-E2，其上帶有6個組氨酸，6個組氨酸在高pH值時與Ni親和柱形成共價結合，從而可將其它菌體雜蛋白逐漸洗脫掉。然后逐漸降低pH，在低pH條件下6個組氨酸與Ni親和柱分離，從而將重組蛋白洗脫，最終獲得較純的重組蛋白。獲得的經純化的重組蛋白，須經離體和在體的活性鑒定，才可最終確定其生物學活性和潛在應用價值，這部分的研究工作正在進行中。

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