癌基因H-ras啟動子區重新甲基化抑制胃癌細胞生長的實驗研究

袁 夢 ，羅 瑾 ，李燕妮 ，耿 鑫 ，張維銘

（1.天津醫科大學生物化學教研室，教育部免疫微環境與疾病重點實驗室，天津300070；2.天津市口腔醫院中心實驗室，天津300041）

表觀遺傳學是研究不涉及DNA序列改變并且可以通過細胞有絲分裂或減數分裂傳代的基因功能（表達）改變的學科，包括DNA甲基化、組蛋白乙酰化，染色質重塑和RNA干擾等。其中DNA甲基化作為表觀遺傳學重要的分子機制之一越來越受到人們的關注[1-2]。腫瘤的發生與基因組和表觀遺傳的改變有著很大的聯系。DNA甲基化是真核生物基因表達調控中一種常見而又重要的機制，基因組正常甲基化模式的改變與各類腫瘤的演變發展有著密切的聯系[3-4]。高甲基化可以抑制腫瘤抑癌基因啟動子區域的轉錄，從而使抑癌基因沉默；而低甲基化會增加基因組的不穩定性，誘導癌基因和腫瘤相關基因的激活，是引起腫瘤發生的原因之一。本研究通過使用甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosylmethionine,SAM）處理人胃癌細胞系MGC-803和人正常胃黏膜上皮細胞系GES-1，以觀察SAM對腫瘤和正常細胞生長的生物學影響，并研究癌基因H-ras啟動子區甲基化的改變及相應蛋白的表達情況，以期在腫瘤的臨床診斷和藥物治療中探討出新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人胃癌細胞系MGC-803由天津市環湖醫院神經外科研究所饋贈，人正常胃黏膜細胞系GES-1購自北京腫瘤醫院遺傳室。

1.1.2 試劑 SAM和Wizard DNA Clean-up System（美國Promega公司）；細胞培養基（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；胰蛋白酶（HyClone公司）；基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）；DNA聚合酶（TaKaRa公司）；細胞免疫熒光染色試劑（北京中山金橋生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及藥物處理 MGC-803細胞貼壁生長于含10%胎牛血清及青、鏈霉素各100 U/mL的RPMI1640培養基中，GES-1細胞貼壁生長于含10%胎牛血清及青、鏈霉素各100 U/mL的DMEM低糖培養基中，傳代24 h后，隨機選取兩個細胞系中的部分細胞，向細胞中加入SAM，使其終濃度為10 μmol/L，作為實驗組，記為 T1(MGC-803藥物處理組)和T2（GES-1藥物處理組）；未經藥物處理的細胞作為對照組，分別記為C1（MGC-803對照組）和C2（GES-1對照組），繼續培養，用于后續實驗。

1.2.2 MTT法 取各組對數生長期細胞按5×103個/孔接種于96孔板中，接種7板。每日取1板,加入MTT（5 mg/mL）20 μL，37 ℃孵育 4 h 后棄上清，再加入DMSO 150 μL，于微型振蕩器上振蕩10 min后，在570 nm酶標儀上檢測各孔吸光度A值，繪制細胞生長曲線圖并計算細胞生長抑制率，按照公式：細胞生長抑制率（%）=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%。實驗重復3次。

1.2.3 甲基特異性PCR 應用DNA提取試劑盒抽提各組細胞的基因組DNA。用新鮮配制的氫醌（10 mmol/L）30 μL 和亞硫酸氫鈉（3 mol/L）520 μL水浴脫氨18 h，Wizard DNA Clean-up system過濾柱純化,無水乙醇沉淀，溶解于30 μL去離子水中。以此為模板,分別用甲基化和非甲基化引物擴增H-ras啟動子序列（引物序列見表1）。擴增條件為：預變性95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環；72℃再延伸10 min。

表1 MSP引物序列Tab 1 The primer sequence of MSP

1.2.4 細胞免疫熒光染色 將各組細胞用0.25%胰蛋白酶消化后,傳代于24孔板，每組2孔，記為H-ras。繼續培養待細胞貼壁穩定后，經過固定、阻斷各種內源性過氧化物酶活性、打孔、封閉等步驟后在H-ras孔中加入兔抗人H-ras單克隆抗體（1∶100稀釋），每孔 300 μL，4℃過夜后，PBS沖洗 3次，在各組的H-ras孔內加入TRITC標記（紅色熒光）的羊抗兔二抗，每孔1 mL，室溫避光反應2 h，棄去二抗，PBS沖洗3次，再加入1 mL PBS，在200倍普通光鏡下計數每視野細胞總數，熒光下計數陽性細胞數，3視野/孔，求平均值,計算著色細胞陽性率。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件包,對所得的數據采用方差分析和χ2檢驗進行統計分析,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SAM對細胞生長的影響 人胃癌細胞中，加入SAM的處理組T1與未經藥物處理的對照組C1相比，細胞的生長增殖活性受到明顯抑制；而人正常胃黏膜上皮細胞，處理組T2與對照組C2的細胞生長情況無明顯差異（圖1、2）。胃癌細胞MGC-803的生長抑制率為22.0%，而正常細胞的生長抑制率為6.8%，兩者差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 胃癌細胞MGC-803生長曲線圖Fig 1 The growth curve of gastric cancer cells MGC-803 by MTT assay

圖2 正常胃黏膜上皮細胞GES-1生長曲線圖Fig 2 The growth curve of human normal gastric mucosa epithelial cells by MTT assay

2.2 MSP檢測癌基因啟動子區域的甲基化狀態 人胃癌細胞中，癌基因H-ras啟動子區處于非甲基化狀態，經過SAM處理后實驗組中癌基因的啟動子區呈現出高甲基化狀態；正常細胞中，實驗組和對照組的H-ras啟動子區均表現為高甲基化（圖3）。

圖3 MSP擴增H-ras啟動子的電泳圖Fig 3 The electropherogram of H-ras promoter by MSP

2.3 細胞免疫熒光染色檢測癌基因蛋白的表達 HRAS蛋白主要表達于未經SAM處理的胃癌細胞中，陽性信號多集中在胞漿中，H-RAS蛋白表現為紅色熒光，而正常細胞系和經過藥物處理的胃癌細胞系幾乎不著色（圖4），著色細胞陽性率見表2。未經SAM處理的實驗組中，H-RAS在正常細胞組C2的著色細胞陽性率明顯低于胃癌MGC-803細胞組C1，差異均有統計學意義（P＜0.05）；經 SAM 處理的胃癌細胞MGC-803中H-RAS的陽性率與對照組相比顯著降低,差異有統計學意義（P＜0.05），對于正常細胞（T2，C2），藥物處理所引起的H-RAS細胞陽性率變化均不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 H-RAS蛋白免疫熒光染色圖Fig 4 Expression of H-RAS protein by cell immunofluorescence assay

表2 H-RAS蛋白免疫熒光染色法所得著色細胞陽性率Tab 2 The cell positive of H-RAS from cell immunofluorescence

3 討論

胃癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤，其發病率居全球腫瘤發病和癌癥死亡率的第二位。原癌基因H-ras突變與胃癌發生密切相關，在胃癌發生發展中起著重要作用。Ras癌基因由K-ras、H-ras和N-ras家族組成，是膜結合型的GTP/GDP結合蛋白，其作用是在細胞生長以及代謝過程中將表皮生長因子和胰島素的刺激信號傳入相應的靶細胞并與細胞內的磷脂酶C結合，從而啟動腫瘤發生。目前已在包括胃癌、大腸癌在內的多種腫瘤中證實了Ras基因的異常改變[5]。

DNA甲基化是真核生物轉錄調控的一個重要的表觀遺傳學機制，許多研究已經證明癌基因啟動子區的低甲基化和抑癌基因的高甲基化是誘發細胞癌變的重要方式[6-8]。Tao等[9]研究發現化學致癌物誘發大鼠肝癌結節中 raf、c-myc、c-fos、c-H-ras、c-K-ras基因啟動子區域低甲基化，且與其蛋白表達升高相關。另外，在上皮性腫瘤乳腺癌、腎細胞癌和卵巢癌中，癌基因RHOA啟動子區低甲基化且轉錄活化，表達增高[10]。本課題組前期研究發現，胃癌細胞中癌基因c-myc啟動子區呈現低甲基化而高表達，而抑癌基因p16啟動子區呈異常高甲基化狀態[11]。本次實驗筆者觀察了胃癌細胞MGC-803中H-ras基因的表達情況，正常細胞系中癌基因H-ras表現出高甲基化，而胃癌細胞系癌基因H-ras則表現出非甲基化狀態，經過SAM藥物處理后胃癌細胞系則呈現出高甲基化狀態。此外，免疫熒光染色實驗顯示胃癌細胞MGC-803在SAM處理后H-RAS蛋白的表達也顯著降低，表明SAM逆轉了基因的低甲基化狀態，同時下調了癌基因及其蛋白的表達。這與Zhao等[12]的結果相似，他們發現在給予不同濃度SAM（0、2、4 mmol/L）處理胃癌細胞后，癌基因cmyc啟動子區域低水平甲基化發生逆轉，重新處于甲基化狀態，同時相應蛋白表達量也明顯下降。進一步證明了H-ras的致癌作用是可逆的，處于低甲基化狀態的癌基因可以重新獲得甲基而失去其原有的惡性增殖的特性，從而逆轉腫瘤的發展。

SAM是生物體內除甲硫氨酸（蛋氨酸）本身甲基化外所有甲基化反應的甲基供體，許多研究利用SAM來抑制癌基因低甲基化，增加DNA甲基化轉移酶的活性[13]。Pouya等[14]以SAM誘導乳腺癌尿激酶（uPA）重新甲基化，發現可以逆轉低甲基化狀態，抑制乳腺癌的轉移。同時，資料表明SAM對胃癌細胞的抑制呈時間和劑量依賴性[12]。本實驗用SAM處理胃癌細胞和正常胃黏膜上皮細胞，在MTT實驗中通過繪制生長曲線圖可以觀察到，給予SAM處理后胃癌細胞MGC-803生長增殖情況較對照組受到明顯的抑制，而正常胃黏膜上皮細胞GES-1的生長情況卻沒有明顯差異。這表明SAM可以有效地抑制腫瘤細胞的生長而不影響正常細胞的生長狀態，有望應用于臨床治療，從而降低藥物對患者正常組織的損傷。然而，值得注意的是在癌癥發生的早期階段，抑癌基因還沒有完全沉默，給予SAM使癌基因重新甲基化的同時可能導致腫瘤抑癌基因的高甲基化[14]。這引發了進一步的思考，如何調整SAM的濃度和劑量來實現癌基因的重新甲基化同時又不抑制抑癌基因的活性，為后續實驗提供了新的方向。

綜上所述，通過檢測H-ras重新甲基化后細胞生長狀況以及基因和蛋白的表達，可以得出癌基因啟動子區域重新甲基化能夠逆轉癌基因的低甲基化狀態，從而抑制腫瘤細胞生長的結論，同時也為降低胃癌的侵襲性和轉移性的臨床治療研究提供新的思路。

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