1A型糖尿病預(yù)防的分子生物學(xué)機(jī)制

喬治

大部分但并非所有的1型糖尿病患者表現(xiàn)免疫介導(dǎo)的疾病形式，即T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性β細(xì)胞破壞而致的1A型糖尿病。對NOD鼠模型的相關(guān)研究顯示，1型糖尿病發(fā)病的根本原因涉及種系編碼序列，由其形成的三分子復(fù)合物構(gòu)成胰島素肽段B：9-23，此肽段由主要組織相容性復(fù)合物II（MHC）的I-Ag7 分子提呈，且能被具有特異性α鏈序列的T細(xì)胞受體識(shí)別。利用遺傳學(xué)檢查、自身抗體檢測及測量代謝性指標(biāo)，現(xiàn)已能夠預(yù)測1A型糖尿病的發(fā)生。免疫治療可延遲β細(xì)胞破壞，但尚不能徹底預(yù)防β細(xì)胞破壞的發(fā)生。隨發(fā)病率的增加，估計(jì)約有100萬美國人患有或?qū)l(fā)生1A型糖尿病，因此預(yù)防1A型糖尿病已成為重要的國際目標(biāo)。為達(dá)此目標(biāo)，需對現(xiàn)在尚處試驗(yàn)階段的免疫療法進(jìn)行不斷改善，以及進(jìn)一步了解1型糖尿病發(fā)病機(jī)理中自身免疫性三分子復(fù)合物的作用。

1A型糖尿病患者既面臨著嚴(yán)重的糖尿病慢性并發(fā)癥，亦需面臨酮癥酸中毒、低血糖狀態(tài)等危及生命的急性并發(fā)癥。人們不斷研究嘗試多種治療途徑，試圖治愈疾病或至少顯著減輕1A型糖尿病給患者及其家屬帶來的沉重負(fù)擔(dān)。由于可提供血糖“實(shí)時(shí)”信息，對低血糖或明顯高血糖進(jìn)行及時(shí)預(yù)警，持續(xù)血糖監(jiān)測已改善了眾多1型糖尿病患者的生活質(zhì)量。數(shù)個(gè)研究小組正致力于研究閉環(huán)胰島素泵，在發(fā)達(dá)國家，此類“智能”胰島素泵很有希望迅速成為胰島素依賴型糖尿病患者的標(biāo)準(zhǔn)治療。此外，胰腺移植（長期）及胰島移植（短期）可治愈1型糖尿病，但對于大多數(shù)病人而言，此類移植的免疫抑制治療相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)不可接受。除異體免疫外，自身免疫也可能限制上述移植治療的效果。

1型糖尿病免疫相關(guān)領(lǐng)域發(fā)展迅速，相關(guān)出版物已有上千篇，本綜述重點(diǎn)關(guān)注的是一個(gè)相對簡單的假設(shè)，即自身免疫性1型糖尿病是慢性T細(xì)胞效應(yīng)所致特異性β細(xì)胞破壞的結(jié)果，而這種靶向效應(yīng)的主要分子決定因子固定于基因組內(nèi)。

盡管存在明顯的表型差異，在分子水平上NOD鼠與1型糖尿病患者間存在驚人的相似。本文將首先探討NOD鼠的疾病發(fā)病機(jī)制（相對易于證誤），而后討論1型糖尿病患者的發(fā)病機(jī)制，最后對相關(guān)臨床試驗(yàn)的進(jìn)展情況進(jìn)行總結(jié)。我們相信NOD鼠1型糖尿病的根本病因是基因組的三個(gè)編碼序列，如圖1所示。我們認(rèn)為相關(guān)的序列是：胰島素肽段B：9-23序列；易感MHC I-Ag7序列；T細(xì)胞受體（TCR）特異性Vα序列。

自身免疫性三分子復(fù)合物

B：9-23胰島素肽段

NOD鼠糖尿病發(fā)生必需的三分子復(fù)合物的第一個(gè)組分是胰島素的一段肽段，即氨基酸9-23。越來越多的證據(jù)顯示，針對胰島素的自身免疫反應(yīng)是NOD鼠1A型糖尿病發(fā)病機(jī)制的中心。Daniel等成功克隆來自NOD鼠胰島的T細(xì)胞，他們的實(shí)驗(yàn)成果對于確定作用于胰島素的T細(xì)胞在1A型糖尿病發(fā)病過程中發(fā)揮作用極其重要。他們發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)CD4 T細(xì)胞克隆起源于對胰島素有反應(yīng)的胰島，且在那些對胰島素有反應(yīng)的胰島中，由B：9-23肽段刺激者超過90%。這些T細(xì)胞克隆能夠加速NOD鼠的糖尿病發(fā)展，其中一些亞群還能在免疫缺乏小鼠中誘導(dǎo)糖尿病。T細(xì)胞克隆及針對胰島自身抗體的轉(zhuǎn)基因TCR能夠?qū)е禄蝾A(yù)防糖尿病。在本文中，盡管我們著重討論的是CD4 T細(xì)胞，但CD8 T細(xì)胞，包括作用于胰島素B15-23序列的T細(xì)胞，同樣具有非常重要的作用。II類等位基因（可能為CD4 T細(xì)胞）在決定人類及動(dòng)物模型患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)方面起決定作用。

圖1 NOD鼠II類表達(dá)分子的始動(dòng)致病性三分子復(fù)合物：I-Ag7/胰島素肽氨基酸B鏈9-23/具TRAV5D-4*04的TCR

鼠類有兩個(gè)胰島素基因。去除胰島素基因1可在90%的NOD鼠中預(yù)防糖尿病的發(fā)生；去除胰島素基因2則急劇加速糖尿病的發(fā)展。兩個(gè)胰島素基因在胰島均有表達(dá)，但胸腺僅有胰島素基因2表達(dá)。胸腺上皮細(xì)胞分泌的小劑量胰島素誘導(dǎo)的免疫耐受效應(yīng)或許是NOD鼠胰島素基因敲除細(xì)胞株具不同表型的原因。然而，刪除其他自身抗原基因如GAD65,IGRP,IA-2，IA-2beta等，并不會(huì)改變NOD鼠糖尿病進(jìn)程。

為了測試以胰島素為靶向目標(biāo)是否為糖尿病發(fā)展所必須，我們聯(lián)合敲除胰島素基因1及胰島素基因2。為預(yù)防代謝性糖尿病在雙重胰島素基因敲除者中的發(fā)生，我們將一個(gè)具有變異胰島素B：9-23肽段的前胰島素基因轉(zhuǎn)入受試對象。之所以選擇這種特殊的變異，是因?yàn)镈aniel等培養(yǎng)的抗B：9-23T細(xì)胞克隆不是由這種突變肽段刺激而來。僅有變異胰島素基因的NOD鼠不發(fā)生糖尿病，不表達(dá)胰島素自身抗體，亦不發(fā)生胰島炎，雖然針對胰島自身反應(yīng)及胰島炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用并不完全。通過移植具正常胰島素基因序列的胰島、以天然B：9-23肽段免疫、或轉(zhuǎn)導(dǎo)天然胰島素基因替代缺乏的天然胰島素基因序列可恢復(fù)胰島素自身抗體的生成。這些后續(xù)研究性質(zhì)復(fù)雜，因?yàn)殡m然移植的胰島具有天然胰島素基因，但胰腺內(nèi)源性胰島并不具備此類基因。為了證明將表達(dá)天然B：9-23基因的胰島移植至雙重基因敲除的小鼠可誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生，研究者將小鼠胰島細(xì)胞轉(zhuǎn)輸入一只胰島表達(dá)天然B：9-23基因的免疫缺乏小鼠。引人注意的是，被移植至腎被膜下方的表達(dá)天然B：9-23基因序列的胰島在4周后誘導(dǎo)了胰島素自身抗體生成，說明特異解剖學(xué)位置（例如胰腺）或胰島素B：9-23肽段的表達(dá)皆非糖尿病發(fā)展所必需。

考慮到NOD鼠T細(xì)胞可識(shí)別的胰島自身抗體數(shù)量,抗原識(shí)別等級成為重要問題。許多研究者證明誘導(dǎo)對胰島素“隱性”免疫耐受的技術(shù)可預(yù)防糖尿病。Krishnamurthy等的近期研究揭示，對胰島素的免疫反應(yīng)是對主要胰島自身抗原IGRP的免疫反應(yīng)的“上游”效應(yīng)。值得注意的是，盡管IGRP CD8反應(yīng)性T細(xì)胞在NOD鼠模型中作用突出，為誘導(dǎo)胰島素耐受而引進(jìn)的具I-E-啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的胰島素原的小鼠不生成IGRP反應(yīng)性T細(xì)胞。即使是以IGRP為靶目標(biāo)的、對胰島素反應(yīng)被阻斷的TCR轉(zhuǎn)基因小鼠，也并不自行發(fā)生糖尿病。因此，對于IGRP的免疫反應(yīng)是針對胰島素原的免疫反應(yīng)的下游效應(yīng)，且并非糖尿病病程進(jìn)展所必需。現(xiàn)階段尚無法回答，針對除胰島素之外的所有胰島自身抗原的反應(yīng)是否為疾病進(jìn)展所必需，因?yàn)閿?shù)種重要的自身反應(yīng)性T細(xì)胞克隆的目標(biāo)抗原未知，或尚未在NOD鼠中進(jìn)行相關(guān)基因敲除實(shí)驗(yàn)。（例如chromagranin，BDC2.5T細(xì)胞的靶抗原）

基因敲除實(shí)驗(yàn)說明特異性胰島自身抗原無關(guān)鍵作用，但這并不能排除這些自身抗原在分子間表位擴(kuò)散后具有重要作用的可能性。檢測此類自身抗原或針對此類自身抗原的T細(xì)胞反應(yīng)可能對糖尿病預(yù)測有重要意義，且用此類抗原進(jìn)行免疫治療可能能夠誘導(dǎo)顯性免疫耐受。一旦NOD鼠已發(fā)生糖尿病，僅具有B16：A突變的胰島素基因序列的胰島移植物迅速被破壞。這說明一旦自身免疫反應(yīng)開始，針對非胰島素分子的抗胰島自免反應(yīng)已足夠破壞胰島，或者在移植物所處環(huán)境中對B16：A序列的識(shí)別改變了抗原表位，這足以導(dǎo)致β細(xì)胞被破壞。值得注意的是，與移植胰島不同，具變異B16:A序列的胰腺內(nèi)胰島能夠抵抗從致病性NOD鼠獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)移所致破壞。這說明在存在抗原表位擴(kuò)散的情況下，雖然無法起到完全的保護(hù)性作用，B：9-23基因序列的缺乏仍具重要作用。

至今為止，基因敲除試驗(yàn)只能通過敲除胰島素基因以影響糖尿病的發(fā)展。與之不同，眾多的胰島自身抗原及其相關(guān)多肽能被用于多種途徑來預(yù)防NOD鼠的糖尿病進(jìn)展。這些對糖尿病的顯著抑制作用通常是通過提高調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能而達(dá)到的。有證據(jù)表明，調(diào)節(jié)性CD4,CD8甚至B淋巴細(xì)胞在影響糖尿病發(fā)展中發(fā)揮作用。通過鼻腔給藥或皮下注射（特別是以完全弗氏佐劑為溶液）胰島素B：9-23肽段，可預(yù)防糖尿病。值得注意的是，皮下注射胰島素B：9-23肽段可能通過激活CD4 T細(xì)胞誘導(dǎo)胰島素自身抗體生成，這些抗體結(jié)合于胰島素而非免疫性肽段。即使是正常的Balb/c小鼠對胰島素B：9-23肽段亦產(chǎn)生上述反應(yīng)。在有合適的II類分子（如，NOD鼠的I-Ag7或Balb/c鼠的I-Ad，二者具有相同的I-A α鏈序列）存在的情況下，肽段誘導(dǎo)胰島素自身抗體產(chǎn)生，其機(jī)制可能是抗B：9-23 CD4T細(xì)胞被活化。雖然胰島自身抗體被誘導(dǎo)生成，除非固有免疫系統(tǒng)被激活（例如，通過注射多聚-IC），否則不會(huì)產(chǎn)生胰島炎。

I-Ag7

鼠類動(dòng)物的CD4 T細(xì)胞的TCR可識(shí)別表達(dá)于II類抗原提呈分子家族的I-E及I-A分子表面溝槽內(nèi)的目標(biāo)肽段，而CD8 T細(xì)胞可識(shí)別表達(dá)于I類抗原提呈分子家族的K、D分子表面溝槽內(nèi)的目標(biāo)肽段。人類中相應(yīng)的分子是DQ(對應(yīng)I-A)、DR(對應(yīng)I-E)、HLA-A,-B,-C（對應(yīng)K、D）。上述抗原提呈分子具有高度多態(tài)性。圍繞溝槽的氨基酸序列與肽段結(jié)合，從而決定免疫反應(yīng)的靶向目標(biāo)。在人類及1型糖尿病的鼠類模型中，II類分子對于NOD鼠糖尿病發(fā)生起著重要作用。基因效應(yīng)非常巨大，僅8只糖尿病小鼠即可證明。這些糖尿病小鼠均具有純合的NOD特異性主要組織相容性區(qū)域（表達(dá)I-Ag7不表I-E），這8只小鼠為NOD鼠和正常對照小鼠的雜交后代。II類分子可能通過改變TCR譜以及提高T細(xì)胞識(shí)別特異性肽段的能力而發(fā)揮作用。特殊的是，I-Ag7分子及人類DR4相關(guān)DQ8分子、DR3相關(guān)DQ2分子均具有特別的結(jié)合袋9，這種結(jié)構(gòu)缺乏天冬氨酸。相關(guān)假設(shè)推測，這種天冬氨酸的缺乏有利于自身抗原性肽段的呈遞，此類肽段具剩余電荷，能夠與特殊的結(jié)合袋9結(jié)構(gòu)相結(jié)合。然而，近期與Kappler實(shí)驗(yàn)室合作的研究有相反發(fā)現(xiàn)，即為致病性TCR識(shí)別的B：9-23肽段在另一個(gè)低親和力區(qū)識(shí)別肽段。胰島素在鼠類及人類的胸腺由特殊胸腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生，且能導(dǎo)致胰島素反應(yīng)性T細(xì)胞的清除。可能胸腺內(nèi)具有以B：9-23為靶向目標(biāo)的TCR的T細(xì)胞很少在低親和力區(qū)遭遇肽段，故得以逃避中樞（如胸腺）免疫刪除。這些逃避了中樞免疫刪除的T細(xì)胞隨后在胰腺內(nèi)極高胰島素濃度環(huán)境下，即可破壞胰島β細(xì)胞。

具有TRAV5D-4*04α鏈片段的TCR

三分子復(fù)合物的第三個(gè)組分是由α鏈及β鏈組成的TCR. 由基因片段的隨機(jī)選擇及重組，形成了數(shù)十億種獨(dú)特的TCR。TCR的最終構(gòu)象類似具6個(gè)指狀結(jié)構(gòu)（互補(bǔ)決定域/CDR）的長管，其中三個(gè)CDR由α鏈提供，其余三個(gè)CDR由β鏈提供。正是這些指狀結(jié)構(gòu)與MHC多肽結(jié)合，繼之活化具TCR的T細(xì)胞。經(jīng)典的對目標(biāo)肽段的識(shí)別通常需要所有CDR共同參與，其中,CDR3一般占主導(dǎo)地位。CDR1與CDR2由基因組編碼，同時(shí)具有Vα和VβTCR片段。與之不同，CDR3的α鏈由隨機(jī)結(jié)合的Vα及Jα基因片段的交界處編碼，其β鏈由V,D,J的交界處編碼。此外，結(jié)合并不精確，可能出現(xiàn)核苷酸的增加或丟失，引起CDR3序列的變異。

考慮到I-Ag7的獨(dú)特性及B：9-23肽段與自身免疫性糖尿病發(fā)病相關(guān)，或許，NOD鼠的抗B：9-23肽段TCR可能具有異常。對Wegmann等發(fā)現(xiàn)的TCR克隆來源的TCR進(jìn)行測序，結(jié)果顯示其中大部分具有特異性的Vα片段，該片段被稱為TRAV5D-4*04（注：每一種獨(dú)特的Vα片段都被賦予相應(yīng)的數(shù)字編號）。意外的是，CDR3的N端及TCRβ鏈不具保守性。故我們認(rèn)為，如果我們建造小鼠模型，使其表達(dá)保守的Vα鏈，同時(shí)不限制其β鏈，允許其形成多種不同的β鏈，則可能誘導(dǎo)胰島自身免疫反應(yīng)的發(fā)生。通過采用Vignali等發(fā)明的技術(shù)，我們建立了具多種不同α鏈序列（包括TRAV5D-4*04）的轉(zhuǎn)基因及逆基因小鼠模型。絕大部分的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了胰島素自身抗體，其中的部分小鼠發(fā)生了糖尿病。通過從此類小鼠獲得融合TCR，我們估計(jì)每100個(gè)具包含抗B：9-23α鏈的TRAV5D-4*04片段的TCR中有1個(gè)與B：9-23發(fā)生反應(yīng)。

以胰島素為目標(biāo)的三分子復(fù)合物中的兩個(gè)組分為多種（TRAV5Dα鏈序列）或所有（胰島素B：9-23序列）鼠類品系共有。換而言之，具I-Ag7是NOD鼠的一種獨(dú)特屬性。其他與維持免疫耐受狀態(tài)或環(huán)境因素（或缺乏保護(hù)性環(huán)境因素如特定病毒感染）有關(guān)的遺傳多態(tài)性影響自身免疫的激活。考慮到能以B：9-23肽段為目標(biāo)的T細(xì)胞數(shù)目可能極大，我們認(rèn)為NOD鼠β細(xì)胞與免疫系統(tǒng)間的互相作用與蜂群相似。一旦免疫耐受狀態(tài)被打破，眾多共享TCR的共同特征T細(xì)胞處于以胰島素為目標(biāo)的預(yù)備狀態(tài)中。

上述假設(shè)尚未接受一系列關(guān)鍵的測試。例如，一個(gè)重要的預(yù)測是：敲除TRAV-5D-4*04基因片段可預(yù)防糖尿病及胰島素自身抗體產(chǎn)生，類似于B：9-23胰島素肽段突變的效果。除了在基因方面反駁共有的Vα序列非常關(guān)鍵的假設(shè)，人們也在積極探索能特異性阻斷上述三分子復(fù)合物的治療手段。

我們正通過兩種途徑對以NOD鼠三分子復(fù)合物為目標(biāo)的治療進(jìn)行研究。Ostrov利用DOCKING程序?qū)CI圖書館內(nèi)為藥物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的140，000個(gè)候選分子進(jìn)行篩選，從而確定了一系列小分子。我們與他合作，確定了能夠調(diào)節(jié)抗B：9-23TCR信號的小分子（A Michels，數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。我們認(rèn)為與I-Ag7的特殊袋狀結(jié)構(gòu)結(jié)合的小分子家族既能增強(qiáng)亦能抑制TCR對于B：9-23肽段的反應(yīng)，還可以改變NOD鼠中占主導(dǎo)地位的TRAV5D-4*04B:9-23T細(xì)胞的特異性細(xì)胞因子反應(yīng)。

此外，我們發(fā)現(xiàn)相關(guān)證據(jù)，證明識(shí)別B：9-23肽段的抗體在I-Ag7的溝槽結(jié)構(gòu)結(jié)合，能夠阻止體外實(shí)驗(yàn)中B：9-23肽段的表達(dá)（L Zhang，數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。在此基礎(chǔ)上，誘導(dǎo)此類具疾病預(yù)防能力的抗體生成的實(shí)驗(yàn)即將進(jìn)行。

人類1型糖尿病的階段劃分

1986年，我們建立了一個(gè)1A型糖尿病的慢性自身免疫發(fā)展過程的模型，將疾病的發(fā)病機(jī)理劃分為一系列的階段（圖2）。至今仍無相關(guān)技術(shù)能夠直接評定β細(xì)胞量，因此，關(guān)于復(fù)發(fā)-緩解疾病進(jìn)程是否與β細(xì)胞破壞有關(guān)以及一些患者的β細(xì)胞破壞是否是急性過程的討論一直存在。在上述模型中，考慮到不同個(gè)體異質(zhì)性，圖2 的X軸沒有強(qiáng)調(diào)精確的時(shí)點(diǎn)。不同個(gè)體以不同速度向顯性糖尿病進(jìn)展，同卵雙生子之一發(fā)生糖尿病與其同胞出現(xiàn)胰島自身抗體之間的時(shí)間可以相差數(shù)十年。通過多個(gè)研究及疾病預(yù)防實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)有可能預(yù)測1A型糖尿病的發(fā)生，這個(gè)可能性在此模型中得到強(qiáng)調(diào)。

第1階段 遺傳易感性

盡管1A型糖尿病通常受多基因遺傳影響，有兩種十分罕見的與糖尿病相關(guān)的自身免疫反應(yīng)綜合征屬于“單基因”遺傳范疇：APS-1（1型自身免疫性多內(nèi)分泌腺病綜合征），IPEX綜合征（免疫失調(diào)，多內(nèi)分泌病變，腸下垂，X連鎖）。

IPEX綜合征由FoxP3基因突變引起，此轉(zhuǎn)錄因子對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)展起重要作用。缺乏FoxP3的患兒將發(fā)生超強(qiáng)的自身免疫反應(yīng)，且約80%患兒會(huì)發(fā)生1型糖尿病。糖尿病癥狀可在患兒出生后數(shù)天內(nèi)即顯現(xiàn)。此綜合征充分證明了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的重要性，除非致病性T細(xì)胞受到控制，否則大多數(shù)人都可能發(fā)生1型糖尿病。對于被診斷為此種致命性自身免疫綜合征的患兒，可考慮進(jìn)行骨髓移植，以提供調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。另一種正在探索中的可能療法是培養(yǎng)表達(dá)FoxP3、具調(diào)節(jié)能力的抗原特異性T細(xì)胞株。

圖2 強(qiáng)調(diào)疾病慢性進(jìn)展屬性的1A型糖尿病發(fā)展進(jìn)程模型。

APS-1較IPEX綜合征常見，且在少數(shù)種群（如伊朗人群、猶太人群）中發(fā)病率稍高，但總體來說仍十分罕見。APS-1的特征是粘膜念珠菌病、Addison氏病及甲狀旁腺功能低下，其病因?yàn)锳IRE（自身免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)者）基因突變。此病通常以常染色體隱性方式遺傳，然而亦有一個(gè)存在顯性突變的家族被報(bào)導(dǎo)，且兩種遺傳方式的動(dòng)物模型均已建立。AIRE基因?qū)τ谠鰪?qiáng)如胰島素等外周抗原在胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)起重要作用。少量“外周”（如胸腺外）抗原如胰島素及胸腺內(nèi)表達(dá)的抗原與自身反應(yīng)性T細(xì)胞的陰性選擇及避免自身免疫反應(yīng)有關(guān)。APS-1患者逐漸發(fā)生一系列自身免疫失調(diào)，且比特定疾病表達(dá)更多的自身抗體。值得注意的是，據(jù)報(bào)導(dǎo)，所有APS-1患者均具有針對干擾素α的自身抗體。約18%的APS-1患者發(fā)生1型糖尿病，其糖尿病的發(fā)展受保護(hù)性HLA等位基因DQB1*0602及胰島素基因多態(tài)性的影響。

總之，上述兩種綜合征是自身免疫性糖尿病遺傳因素起決定作用的極端例子，證明一個(gè)或兩個(gè)維持免疫耐受狀態(tài)所必需的通路被打破將導(dǎo)致疾病的發(fā)生。當(dāng)控制免疫耐受的基因突變程度超過維持避免自身免疫反應(yīng)發(fā)生的正常多基因狀態(tài)時(shí)，人們易于發(fā)生1型糖尿病。

APS-2綜合征較APS-1綜合征更常見。APS-2綜合征的臨床特征是同一個(gè)體發(fā)生多種自身免疫失調(diào)（如1A型糖尿病，Addison氏病，甲狀腺炎，腹腔疾病等）。它復(fù)雜的遺傳機(jī)制類似1A型糖尿病，但與之不完全相同。特別是，Addison氏病的最高危HLA基因型（DR3/4-DQ2/8）為DRB1*0404而非DRB1*0401或DQB1*0302。患1A型糖尿病的病人發(fā)生APS-2的一系列自身免疫失調(diào)的可能性增加，特別是Addison氏病、腹腔疾病、甲狀腺自身免疫反應(yīng)以及惡性貧血。我們通過一系列測試對1型糖尿病患者進(jìn)行常規(guī)篩查，目的是排除相關(guān)聯(lián)的針對腎上腺、小腸、甲狀腺的自身免疫反應(yīng)，這些檢查包括：通過檢測21羥化酶抗體檢查Addison氏病（陽性率1.5%），通過檢測轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抗體檢查腹腔疾病（陽性率10%），通過檢測TSH檢查甲狀腺疾病。在診斷為1型糖尿病1年內(nèi)，約三分之一的病人已經(jīng)有一種或多種針對其他靶器官的自身抗體表達(dá)。

1A型糖尿病已經(jīng)成為研究的最透徹的復(fù)雜遺傳性疾病之一。大約每300個(gè)美國公民中有1人患有1A型糖尿病，而約每20個(gè)糖尿病患者1級親屬中就有1人患1A型糖尿病。我們還觀察到，父親為1型糖尿病患者的兄弟姊妹及后代患1型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)高于母親為1型糖尿病患者的后代。經(jīng)過長期隨訪發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)1型糖尿病患者的同卵雙生子發(fā)生胰島自身免疫反應(yīng)（＞70%）與糖尿病（＞60%）。同卵雙生子的兩人發(fā)生糖尿病的時(shí)間可相差30年。然而，異卵雙生子發(fā)生糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)與兄弟姊妹沒有區(qū)別，約為5%。

如上所述，盡管存在很強(qiáng)的遺傳傾向，絕大多數(shù)（＞90%）1A型糖尿病患者不具有患糖尿病的一級親屬。雖然40%丹佛市人群攜帶高危HLA等位基因DR3或DR4，其中僅有2.4%的人口攜帶最高危基因型，即DR3與DR4，且這種雜合子個(gè)體占青少年糖尿病患者的30%。因此，在總?cè)巳褐幸赘械任换驍y帶率較高的情況下，從父母雙親遺傳得來HLA基因型對于1型糖尿病的發(fā)展非常重要。

與NOD鼠模型相似，1A型糖尿病的主要基因決定因素是II類MHC基因DQ、DR和DP（依此順序）的多態(tài)性。最高危基因表型由1個(gè)DRB1*0301-DQA1*0501-DQB1*0201單倍體型和另一個(gè)DR4單倍體型（DRB1*0401-DQA1*0301-DQB1*0302，簡記為DR3/4-DQ2/8）構(gòu)成。約30%～50%患1A型糖尿病的患兒攜帶這種基因表型（注：患者發(fā)病年齡越輕，攜帶此基因表型的可能性越大）。在總?cè)巳褐袛y帶此基因表型者患1A型糖尿病的絕對風(fēng)險(xiǎn)約為5%。DRB1*0403等位基因降低DR4單倍體型攜帶者的患病風(fēng)險(xiǎn)，一些DP等位基因也能改變風(fēng)險(xiǎn)（如DPB1*0402）。此外，有數(shù)種HLA等位基因具有極強(qiáng)的保護(hù)作用。DQB1*0602的保護(hù)作用尤其明顯，總?cè)丝谥屑s20%攜帶此等位基因，但僅1%的1A型糖尿病患者攜帶該等位基因。

由Marian等牽頭的DAISY研究，測試了科羅拉多州丹佛市超過30,000名新生兒的HLA表型，繼之對總體中超過1,000名攜帶HLA高危基因的患兒及1,000名HLA無關(guān)的一級親屬進(jìn)行隨訪。1型糖尿病患者的同胞患病率是患者后代的數(shù)倍，盡管患者的同胞及后代均有與先證者相同的一半基因組。可能有多個(gè)遺傳及環(huán)境因素共同造成同胞患病率較高，但最簡單的解釋是MHC內(nèi)基因表現(xiàn)其他多態(tài)性而增加特定單倍體型的風(fēng)險(xiǎn)。攜帶兩個(gè)與先證者同胞相同的HLA單倍體型的DR3/4-DQ2/8同胞，與只攜帶一個(gè)/或不攜帶與先證者同胞相同的HLA單倍體型的DR3/4-DQ2/8同胞相比，具有極高的糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)。這一現(xiàn)象說明了上述解釋的可能性。DAISY研究中此類同胞的胰島自身免疫反應(yīng)被激活的風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)70%，且此類同胞占了DAISY研究中所有進(jìn)展為胰島自身免疫及稍后的糖尿病狀態(tài)患兒中的大部分。在DAISY研究中，通過對DR,DQ及DP的分型，可確定總?cè)巳褐屑s有20%的高危人群。然而，占總?cè)丝诩s20%的DR3/DR4雜合子個(gè)體的患病風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)低于約占70%的與先證者具相同DR3/4表型的個(gè)體，這意味著MHC中尚存額外的基因多態(tài)性有待發(fā)掘。我們找到相關(guān)證據(jù)表明其中一個(gè)位點(diǎn)位于MHC端粒酶端，且特定的HLA I類等位基因與此風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，特別是表達(dá)于2%～4%患者中的HLA-B39。另外，HLA-A24與早發(fā)性1A型糖尿病相關(guān)。值得注意的是，HLA B39的表達(dá)可增加DR8單倍體型的患病風(fēng)險(xiǎn)。

考慮到MHC數(shù)百萬的堿基對的多個(gè)幾乎完全保守的單倍體型（其中兩個(gè)最為大家熟知的保守單倍體型為HLA-A1,B8,DR3單體型及HLA-A30,B18,DR3“Basque”單體型），尋找MHC中的那些非HLA疾病決定因子十分困難。“Basque”單體型較A1,BB,DR3單體型風(fēng)險(xiǎn)更高，盡管兩種單體型的DR和DQ等位基因序列相同。考慮到兩種單體型均具DR3，二者的糖尿病罹患風(fēng)險(xiǎn)均升高。

因?yàn)橐恍┨囟ǖ腍LA等位基因可提供巨大的保護(hù)作用，人們開始考慮是否此類等位基因能夠運(yùn)用于糖尿病治療或家庭計(jì)劃中。這些具保護(hù)作用且決定患病風(fēng)險(xiǎn)的等位基因可能是決定以哪些特定自身分子結(jié)構(gòu)為靶向的“正常”HLA等位基因。例如，對1A型糖尿病具保護(hù)作用的DR2-DQB1*0602單倍體型是多發(fā)性硬化的最高危單體型。

圖3 與先證者同胞兩個(gè)單倍體型均相同的、攜帶DR3/4-DQ2/DQ8等位基因的同胞發(fā)生胰島自身免疫及糖尿病所處極限風(fēng)險(xiǎn)

人們現(xiàn)已在識(shí)別與遺傳風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的非MHC位點(diǎn)方面取得了較大進(jìn)展，超過40個(gè)位點(diǎn)已得以確認(rèn)。但多數(shù)此類遺傳位點(diǎn)的優(yōu)勢比（OR值）小于1.2（注：OR值為1.0意味無風(fēng)險(xiǎn)，MHC的OR值＞6），其總和影響遠(yuǎn)小于MHC對糖尿病的影響。繼MHC之后，下一個(gè)最重要的位點(diǎn)是胰島素基因。胰島素基因一個(gè)序列的5’端的保護(hù)性多態(tài)性增加胸腺胰島素的表達(dá)，降低糖尿病風(fēng)險(xiǎn)，而這可能是通過增加胸腺內(nèi)對以胰島素為靶向目標(biāo)的T細(xì)胞的刪除實(shí)現(xiàn)的。

PTPN22基因是第三個(gè)重要的基因位點(diǎn)。一個(gè)氨基酸（R640W）的改變即可增加糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，其OR值約為2。PTPN22基因編碼的分子（lyp）是一種淋巴細(xì)胞特異性酪氨酸磷酸化酶，與疾病相關(guān)的多態(tài)性增加對TCR信號通路的抑制，可能是通過功能獲得機(jī)制實(shí)現(xiàn)。這種功能獲得究竟如何影響糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)尚不清楚，但主流假設(shè)是它可以減少胸腺內(nèi)T細(xì)胞的陰性選擇。另外，亦有許多特定的基因包括CTLA4、CCR5、IL2受體及許多包含一個(gè)或多個(gè)潛在相關(guān)基因的位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)。一種與干擾素信號通路相關(guān)的解旋酶（IFIh1）有幾個(gè)少見的變異，這些變異與患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，也與單核苷酸多態(tài)性相關(guān)。似乎所有已確認(rèn)的位點(diǎn)均通過作用于免疫系統(tǒng)而影響糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)。有趣的是，與2型糖尿病相關(guān)的基因多態(tài)性基本對1型糖尿病的發(fā)展無影響，盡管也有報(bào)導(dǎo)稱TCF7L2基因多態(tài)性與成人隱匿性自身免疫性糖尿病相關(guān)聯(lián)。總的來說，1A型糖尿病與2型糖尿病的遺傳學(xué)機(jī)制可能不同，1A型糖尿病主要是一種免疫介導(dǎo)的疾病。

關(guān)于與1型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的罕見基因變異的研究幾乎還未起步，但可能存在多個(gè)這樣的變異。此外，MHC的單個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)尚有待研究，其中的一些位點(diǎn)可能能夠調(diào)節(jié)疾病風(fēng)險(xiǎn)，且其調(diào)節(jié)能力可能遠(yuǎn)超已發(fā)現(xiàn)的MHC外的共同變異的調(diào)節(jié)作用。多個(gè)共同通路引起對1型糖尿病的易感性，包括以多肽抗原（I類和II類HLA）為靶向的T細(xì)胞；以胰島素原/胰島素為靶向的T細(xì)胞，特別是TCR信號通路（例如PTPN22,CTLA4）；免疫耐受機(jī)制維持（例如，foxP3、AIRE）以及新生兒免疫反應(yīng)（例如IFIh1）。現(xiàn)在已經(jīng)可以識(shí)別與已知HLA基因型/單體型相關(guān)的1A型糖尿病的高危或極高危個(gè)體，此外，胰島素位點(diǎn)及PTPN22對識(shí)別糖尿病高危個(gè)體亦有一定幫助。OR值小于1.2的位點(diǎn)的SNPs對于遺傳學(xué)預(yù)測無幫助，但很可能有助于闡明重要的發(fā)病機(jī)制。雖然可以通過HLA分析（如DR3/4雜合子）識(shí)別極高危個(gè)體，但他們僅構(gòu)成不到一半的1A型糖尿病患者，且近50年來存在著DR3/4攜帶者中糖尿病患者比例下降的趨勢。應(yīng)對總體人群中的高危個(gè)體進(jìn)行與1型糖尿病患者家屬類似的預(yù)防性測試。這樣，如果將基因篩查與胰島自身抗體檢查相結(jié)合，有可能在糖尿病初發(fā)時(shí)即預(yù)防其發(fā)病、降低死亡率。

圖4 1型糖尿病的全基因組關(guān)聯(lián)性研究結(jié)果

第2階段：環(huán)境觸發(fā)

過去的20年間，我們獲得的關(guān)于環(huán)境因素對1型糖尿病影響的相關(guān)認(rèn)識(shí)甚少。盡管如此，過去20年間西方國家1型糖尿病發(fā)病率成倍增長的事實(shí)，清楚的說明了環(huán)境方面的決定因素十分重要。發(fā)病率的增長速度如此之快，單純以人群基因變異已無法解釋。為此提出的一個(gè)重要假設(shè)是“衛(wèi)生學(xué)”假設(shè)，即感染性疾病的減少導(dǎo)致多種免疫性疾病發(fā)病增加，包括哮喘和糖尿病。據(jù)報(bào)道，若將NOD鼠與BB鼠于無菌環(huán)境中飼養(yǎng)，其糖尿病發(fā)病情況發(fā)生改變。近期研究亦指出動(dòng)物模型中的小腸內(nèi)微生物群可調(diào)節(jié)糖尿病的發(fā)展。另一個(gè)假設(shè)提出，胰島素抵抗從某種程度上加速1型和2型糖尿病的發(fā)展速度，且盡管二者的MHC存在區(qū)別，但1型和2型糖尿病有相似的遺傳學(xué)病因。雖然與肥胖相關(guān)的胰島素抵抗可能通過降低胰島素分泌影響1型糖尿病進(jìn)展，但近期的遺傳學(xué)分析不支持上述“衛(wèi)生學(xué)”假說。

值得注意的是，一些藥物能誘導(dǎo)1A型糖尿病的發(fā)展。尤其值得注意的是，干擾素治療與動(dòng)物模型中糖尿病發(fā)生相關(guān)，而對于人類，干擾素治療能誘發(fā)胰島素自身抗體產(chǎn)生、加速糖尿病進(jìn)展、導(dǎo)致酮癥酸中毒。甲巰咪唑、青霉胺和硫辛酸（如含巰基藥物）能誘導(dǎo)自身抗體生成，且有時(shí)抗體滴度很高，足以對代謝產(chǎn)生影響（例如，胰島素自身免疫綜合征：與DRB1*0406相關(guān)的Hirata病）。

其他可能的環(huán)境影響因子包括飲食因素，有報(bào)道稱牛奶、早期引入谷類食物、ω-3脂肪酸水平降低及維生素D水平降低均影響糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)。目前，大規(guī)模實(shí)驗(yàn)及前瞻性研究可以對這些假設(shè)進(jìn)行嚴(yán)格的檢測。值得注意的是，代謝物組學(xué)及mRNA序列分析現(xiàn)均被用于識(shí)別抗胰島自身抗體出現(xiàn)前可能的異常狀態(tài)。因?yàn)榇祟惙椒ㄐ枰治龆鄠€(gè)參數(shù)指標(biāo)，同時(shí)檢測上千個(gè)可能的指標(biāo)，故可能產(chǎn)生許多假陽性結(jié)果，使重復(fù)性試驗(yàn)變得至關(guān)重要。這既是此方法的優(yōu)勢，同時(shí)又是潛在的缺點(diǎn)。

在發(fā)現(xiàn)1A型糖尿病為慢性免疫性疾病之前，有許多關(guān)于病毒感染誘導(dǎo)糖尿病的研究。因此，研究者們在患者糖尿病發(fā)病時(shí)尋找病毒感染的證據(jù)，包括研究糖尿病發(fā)病時(shí)死亡患者的胰腺。其中，研究最多的是先天性風(fēng)疹病毒感染及腸道病毒感染，雖然現(xiàn)在尚無法確定其重要性。主要的困難是在糖尿病發(fā)生數(shù)年前誘導(dǎo)胰島自身免疫反應(yīng)，以及觸發(fā)胰島自身免疫的病毒可能有多種、普遍存在于體內(nèi)、在短時(shí)間內(nèi)發(fā)揮作用。上述認(rèn)識(shí)均來自于小鼠模型的病毒誘導(dǎo)的自身免疫性糖尿病的相關(guān)研究。

通過研究糖尿病抵抗性BB鼠模型，發(fā)現(xiàn)感染KRV可誘導(dǎo)糖尿病，人們獲得了1A型糖尿病的最佳動(dòng)物模型。抗糖尿病性BB鼠作為正常對照鼠類而被培養(yǎng)，它們?nèi)狈B鼠類原始品系的淋巴細(xì)胞減少癥，而正是BB鼠的這一特征使其自發(fā)性發(fā)生糖尿病。一部分BB-DR鼠自發(fā)性發(fā)生糖尿病，隨后的研究發(fā)現(xiàn)這些小鼠被KRV病毒感染，于是人們發(fā)現(xiàn)KRV感染可誘導(dǎo)糖尿病發(fā)生。現(xiàn)在我們知道，多個(gè)具有相同II類MHC等位基因（如RT1-U）及特定TCR位點(diǎn)的的鼠類品系，在被數(shù)種不同病毒感染或以包括Toll樣受體（TLR）激動(dòng)劑的免疫誘導(dǎo)劑刺激時(shí)，均可發(fā)生糖尿病（以不同疾病發(fā)展速度）。多聚IC是一種病毒RNA模擬物，也是TLR3的激動(dòng)劑，給予在胰島β細(xì)胞表面表達(dá)B7分子的鼠類多聚IC，小鼠也發(fā)生糖尿病。在這個(gè)模型中，多聚IC誘導(dǎo)干擾素α生成。抗干擾素α的抗體阻斷糖尿病發(fā)展，而干擾素本身誘導(dǎo)糖尿病發(fā)生。KRV并不感染胰島β細(xì)胞，且只需短時(shí)間被呈遞即可誘導(dǎo)糖尿病。如果一種病毒可在人類中誘發(fā)糖尿病，那么，我們認(rèn)為，依靠相對短時(shí)間內(nèi)監(jiān)視個(gè)體的急性感染與胰島自身抗體的最初表達(dá)可以發(fā)現(xiàn)這樣的病毒，且此種具誘導(dǎo)作用的病毒應(yīng)該普遍存在于體內(nèi)。

第3階段：活化的自身免疫

免疫細(xì)胞化學(xué)（ICA）試驗(yàn)檢測一系列與多個(gè)已知自身抗原（除胰島素外）反應(yīng)的自身抗體，且其結(jié)果對于確定靶向分子十分重要。對ICA試驗(yàn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及解釋試驗(yàn)結(jié)果很困難，因?yàn)榇嬖趥€(gè)體異質(zhì)性，且試驗(yàn)需要利用冰凍的人類胰腺組織作為酶作用物。

胰島自身抗體的表達(dá)是存在胰島自身免疫反應(yīng)的最佳標(biāo)志。現(xiàn)已確認(rèn)四種主要的胰島自身抗原（即胰島素、GAD65、IA-2和Znt8），且國際學(xué)術(shù)研討會(huì)已證實(shí)檢測這些自身抗體的試驗(yàn)的可靠性。ZnT8是最近被確認(rèn)的自身抗原，它是胰島特異性鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，在將鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)至胰島素分泌顆粒的運(yùn)輸中發(fā)揮作用。有趣的是，ZnT8的一個(gè)導(dǎo)致單個(gè)氨基酸改變的普遍多態(tài)性是抗ZnT8自身抗體的主要目標(biāo)。攜帶特定ZnT8變異的純合子患者體內(nèi)通常產(chǎn)生針對其本身基因組編碼的變異體的自身抗體，這證明了此靶向作用本質(zhì)為自身免疫反應(yīng)。

預(yù)測1A型糖尿病的最簡單方法是：四種“生化”自身抗體中有兩種或兩種以上的表達(dá)即預(yù)示個(gè)體有患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。現(xiàn)在尚不知為何這樣的組合性預(yù)測如此有效，但無效假設(shè)是這僅與統(tǒng)計(jì)學(xué)的概率有關(guān)。結(jié)合二項(xiàng)分布原理及Bayers原理，可以計(jì)算結(jié)合自身抗體檢測的陽性率及陰性率的預(yù)測值。特別是通過計(jì)算可獲得利用現(xiàn)有四個(gè)試驗(yàn)檢測出一個(gè)或多個(gè)、兩個(gè)或多個(gè)胰島自身抗體的概率。若這些試驗(yàn)以第99百分位數(shù)值為界，約有4%的正常個(gè)體也可能出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)自身抗體陽性反應(yīng)，然而只有0.06%的正常人出現(xiàn)兩個(gè)及以上抗體陽性。若以第95位百分位數(shù)值為界，相應(yīng)的假陽性率是1.4%。無論出自研究或臨床目的，當(dāng)試驗(yàn)的假陽性率達(dá)5%，聯(lián)合多個(gè)試驗(yàn)將導(dǎo)致問題產(chǎn)生，可能造成1A型糖尿病低風(fēng)險(xiǎn)人群（例如臨床診斷為2型糖尿病的患者）胰島自身抗體的檢測結(jié)果混亂。對于此類人群，以第95位百分位數(shù)值為界，可保持診斷的特異性（如1.4%的假陽性率），而不出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)自身抗體的表達(dá)。

“生物學(xué)”的胰島自身抗體假陽性結(jié)果并不代表缺乏與自身抗原結(jié)合的自身抗體，亦不等于確定存在自身抗體的表達(dá)。可能存在真正的自身抗體表達(dá)，然而尚受它們識(shí)別的抗原表位、自身抗體的水平、缺乏多重自身抗體的表達(dá)等多個(gè)因素的影響，因此自身抗體表達(dá)并不一定意味著糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)增高。低親和力胰島素自身抗體可單獨(dú)存在，而大多數(shù)具此類自身抗體的兒童并不會(huì)進(jìn)展為糖尿病，即是很好的證明。最近，Hampe等報(bào)告，正常人具有個(gè)體基因型抗體，去除這種抗體后，正常血清對GAD65呈陽性反應(yīng)。該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)復(fù)雜，且存在人單克隆抗GAD65自身抗體從微珠上被洗脫的可能。此新發(fā)現(xiàn)有待進(jìn)一步研究的檢測。

類似的，缺乏所有胰島自身抗體的表達(dá)并不等同于不存在1A型糖尿病。在對兒童的糖尿病進(jìn)程的隨訪過程中，常可觀察到自身抗體表達(dá)的波動(dòng)，可表現(xiàn)為一抗體水平降低而另一抗體水平升高。有一小部分自身抗體陽性的兒童在糖尿病發(fā)病前所有自身抗體表達(dá)均消失。如果患兒出現(xiàn)糖尿病表現(xiàn)但不表達(dá)四種標(biāo)準(zhǔn)生化自身抗體中的任意一個(gè)，按程序應(yīng)考慮單基因突變糖尿病，因?yàn)樘悄虿〉暮币娦问剑鏒IDMOAD/Wolfram綜合征等，將對治療的選擇（如使用磺脲類藥物）及疾病預(yù)后產(chǎn)生極大影響。據(jù)估計(jì)，缺乏胰島自身抗體的糖尿病患兒中有10%屬于單基因突變糖尿病。

胰島素自身抗體非常獨(dú)特，因?yàn)槠涞味人郊瓣栃月逝c糖尿病發(fā)病時(shí)的年齡呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。在引入胰島素治療數(shù)周內(nèi)，幾乎所有的個(gè)體均表達(dá)胰島素抗體，現(xiàn)階段尚無法區(qū)分此抗體與胰島素自身抗體。胰島素自身抗體通常（但并不一定）是患兒出生后體內(nèi)第一個(gè)出現(xiàn)的抗體，隨后依次出現(xiàn)的是GAD65，IA-2，ZnT8。總的來說，應(yīng)該盡量避免使用標(biāo)準(zhǔn)化ELISA法測試這些抗體，然而，一種新型GAD檢測方法運(yùn)用抗GAD自身抗體取代標(biāo)準(zhǔn)ELISA法中的GAD自身抗原檢測，這種方法在國際研討會(huì)中獲得好評。

臨床上可能需要即時(shí)篩查測驗(yàn)以檢測胰島自身抗體，而且如果預(yù)防性治療被引入臨床實(shí)踐，這種需要將變得迫切。現(xiàn)在大部分的檢查費(fèi)用主要是標(biāo)本運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室及相關(guān)文書工作的花費(fèi)。如果可應(yīng)用即時(shí)篩查測驗(yàn)，則可以在醫(yī)生辦公室內(nèi)直接進(jìn)行抗體檢測，根據(jù)結(jié)果可建議進(jìn)一步行確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，以及對表達(dá)一種及一種以上自身抗體的異常個(gè)體進(jìn)行疾病分期。現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室最難掌握的檢測技術(shù)是胰島素自身抗體的測量，而多數(shù)檢測GAD65、IA-2和ZnT8抗體的液態(tài)放射性分析技術(shù)在國際研討會(huì)上已獲得一致好評。

第4階段：進(jìn)行性代謝異常

可以通過多種途徑來評價(jià)糖尿病患者的代謝異常進(jìn)展?fàn)顩r。其中特異性最高的一種方法是經(jīng)靜脈的葡萄糖耐量試驗(yàn)。大部分病程在1年內(nèi)的糖尿病患者接受葡萄糖注射后，產(chǎn)生1+3分鐘胰島素分泌，分泌量少于正常對照的第一位百分位數(shù)值。此法也是采用靜脈注射途徑的最不方便的方法之一。口服葡萄糖耐量試驗(yàn)亦能高效預(yù)測患者的病情惡化程度。在諸如DAISY的研究中，我們利用指尖采血法測量A1C水平。研究結(jié)果表明，絕大多數(shù)（但并非所有）糖尿病患兒的A1C水平于顯性糖尿病發(fā)生前1～2年內(nèi)在正常范圍內(nèi)逐漸升高。隨著A1C水平漸升，則應(yīng)采用口服葡萄糖耐量試驗(yàn)以明確糖尿病的診斷。

第5階段：顯性糖尿病

顯性1A型糖尿病的進(jìn)展通常十分迅速，或許這對于器官特異性自身免疫性疾病而言屬于正常情況。在表達(dá)21羥化酶自身抗體的顯性Addison氏病患者中，可以觀察到類似的ACTH值急劇增加。可能大多數(shù)1A型糖尿病患者在患病數(shù)月甚至一年后才確診為糖尿病，故他們的A1C水平升高，有些患者血糖水平甚至超過1,000mg/dl。在糖尿病發(fā)病時(shí)死亡的患兒，對他們進(jìn)行評估的首位衛(wèi)生工作者通常未能做出糖尿病的診斷，而延誤治療數(shù)天可能造成致命性的后果。在如DAISY之類的研究中，在預(yù)先確定有患糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的兒童中，可以避免此類糖尿病以急性發(fā)病形式呈現(xiàn)。一旦糖尿病發(fā)生，之后對于疾病進(jìn)程的隨訪應(yīng)以C肽分泌能力的降低為首要監(jiān)測指標(biāo)。

第6階段：胰島素依賴階段

關(guān)于長病程的1型糖尿病患者體內(nèi)C肽和β細(xì)胞數(shù)量上的殘存存在爭議。例如，有證據(jù)表明一些兒童期起病的長病程糖尿病患者胰腺內(nèi)尚殘存一些表達(dá)胰島素的細(xì)胞，同時(shí)亦存在β細(xì)胞凋亡。幸運(yùn)的是，通過由Atkinson發(fā)起的nPOD項(xiàng)目，大部分從捐獻(xiàn)遺體獲得的胰腺可迅速被用于組織學(xué)分析，其優(yōu)勢之一是可獲得整體形式的胰腺，故可對器官的多個(gè)部分進(jìn)行分析。從1型糖尿病患者及非糖尿病患者捐獻(xiàn)的遺體獲得的胰腺均被進(jìn)行分析，切片圖片展示于網(wǎng)站上（www.jdrfnpod.org）以便國際性科研。研究者可用臺(tái)式電腦觀察這些切片，效果與通過顯微鏡觀察一致。現(xiàn)已明確，部分兒童期起病的臨床診斷為1型糖尿病的患者體內(nèi)仍有大量的β細(xì)胞，這些患者胰島內(nèi)的任意地方都有β細(xì)胞，但可能這些患者并無1A型糖尿病，他們的疾病可能與發(fā)生在美國小部分人口中的、具酮癥傾向的糖尿病有關(guān)。nPOD項(xiàng)目中大多數(shù)長病程的兒童期起病糖尿病患者胰腺的胰島內(nèi)無β細(xì)胞，大約10%的患者有少量具胰島素分泌功能的胰島組織含β細(xì)胞。這種小葉區(qū)尚存β細(xì)胞的異質(zhì)性有可能解釋此類患者的1A型糖尿病病程進(jìn)展緩慢。這種情況使人聯(lián)想到白癜風(fēng)患者成片的皮膚中黑色素細(xì)胞的破壞（圖5）。

預(yù)防β細(xì)胞破壞的試驗(yàn)

雖然多種干預(yù)措施都未能成功地在診斷后預(yù)防1型糖尿病的進(jìn)展或β細(xì)胞的破壞，我們正在進(jìn)入一個(gè)有數(shù)種能夠減輕β細(xì)胞破壞的免疫療法時(shí)代，數(shù)個(gè)相關(guān)Ⅲ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行或在計(jì)劃中。然而，我們?nèi)匀狈τ嘘P(guān)其長期療效、安全性、發(fā)揮療效途徑等方面的關(guān)鍵信息，因此尚需進(jìn)一步研究。從大體上可將這些免疫療法分為兩種，一種對機(jī)體整體發(fā)揮免疫抑制及免疫調(diào)節(jié)作用，另一種為抗原特異性的免疫療法。以現(xiàn)有資料來看，免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)有效的可能性更大，但其風(fēng)險(xiǎn)亦更高。在本文中，我將重點(diǎn)討論四種療法，它們均從一定程度上（因?yàn)槿狈Α瓣栃浴痹囼?yàn)，而大規(guī)模的對照試驗(yàn)數(shù)目亦十分有限）被證明有效。

美國國立衛(wèi)生研究所（NIH）糖尿病預(yù)防試驗(yàn)評估了對胞漿胰島自身抗體陽性的1型糖尿病親屬從腸道外途徑給予胰島素及口服胰島素（目的是誘導(dǎo)“口服耐受”）的方法。依照其胰島素抗體表達(dá)情況、代謝異常情況及是否具有保護(hù)性HLA等位基因DQB1*0602，對研究對象進(jìn)行分期。此外，對GAD65和ICA512自身抗體進(jìn)行了測量，盡管未將此二者納入預(yù)測患病風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)中。大規(guī)模的研究，如ENDIT預(yù)防性研究對煙堿進(jìn)行研究，證明在相對大規(guī)模的情況下可對1型糖尿病進(jìn)行預(yù)測，對患病的不同風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行分級。總的來說，上述研究不能影響糖尿病病程的進(jìn)展，但也有例外。在一個(gè)口服胰島素試驗(yàn)中，一小群具有高水平胰島素自身抗體的實(shí)驗(yàn)對象口服胰島素后糖尿病進(jìn)程顯著減慢（圖6）。為此，NIH TrialNet 小組正在進(jìn)行相關(guān)研究，力圖明確口服胰島素治療在表達(dá)多種胰島自身抗體的胰島自身抗體陽性的患者親屬及具胰島素自身抗體者中是否能減緩糖尿病的進(jìn)展。

圖6 一個(gè)具最高胰島素自身抗體水平的胰島自身抗體陽性患者親屬亞群在接受口服胰島素治療誘導(dǎo)粘膜免疫耐受后，糖尿病進(jìn)程延緩。

在1型糖尿病發(fā)病時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的主要變量是殘存C肽水平。GAD65是人類自身免疫的一個(gè)主要目標(biāo)，因此GAD65是預(yù)測糖尿病進(jìn)展的最優(yōu)預(yù)測指標(biāo)之一。一項(xiàng)小規(guī)模的隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以明礬為免疫佐劑的GAD65可延遲C肽水平的降低，但尚不能改善患者A1C水平或減少胰島素需求量。關(guān)于明確GAD65疫苗作用的相關(guān)驗(yàn)證性試驗(yàn)正在進(jìn)行中，其中包括一項(xiàng)新近啟動(dòng)的TrialNet研究。

在兩個(gè)單獨(dú)利用兩種不同的抗CD3抗體的實(shí)驗(yàn)中，C肽分泌能力喪失均得以明顯延遲。實(shí)驗(yàn)對抗CD3抗體進(jìn)行了改進(jìn)，以減少細(xì)胞因子釋放、限制急性毒性作用。C肽分泌能力喪失被延緩至6～12個(gè)月后，之后C肽水平繼續(xù)降低（盡管已被延緩），與對照組相似。胰島素利用率降低與C肽降低減少相關(guān)。有證據(jù)表明，除了引起急性及一過性T細(xì)胞耗竭，上述療法還能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特別是CD8調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成。Ⅲ期實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行更長時(shí)間的隨訪及對更多的個(gè)體進(jìn)行評估，以判斷此療法的有效性及潛在毒性。

一項(xiàng)近期的TrialNet研究指出，單獨(dú)應(yīng)用抗B細(xì)胞抗體—抗CD20，能顯著延緩C肽喪失，改善A1C水平，減少胰島素需求量。數(shù)月到一年內(nèi)，抗CD20減少循環(huán)中的B淋巴細(xì)胞，但并不以漿細(xì)胞為目標(biāo)。許多抗體水平在此療法中無變化，而特定的自身抗體被明顯抑制。抗CD20抗體曾被用于B細(xì)胞淋巴瘤的治療，且對于多發(fā)性硬化及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎均有效。故較抗CD3抗體，抗CD20抗體的應(yīng)用有更多的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)。盡管如此，必須進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)以評價(jià)將其作為一種藥物單獨(dú)用于治療糖尿病患者及新發(fā)糖尿病患者的有效性和安全性。更新的抗CD20抗體及一系列治療性靶向B細(xì)胞正在研制中。從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)獲得證據(jù)，表明調(diào)節(jié)性B細(xì)胞被誘導(dǎo)生成，且B細(xì)胞可能對于胰島自身抗體的表達(dá)有重要作用。

到目前為止，上述療法均無法取得長期、徹底阻止糖尿病進(jìn)展的效果。引人注目的是，盡管糖尿病進(jìn)展為十分緩慢的破壞性進(jìn)程，1A型糖尿病的自身免疫反應(yīng)對于免疫治療療效反應(yīng)極弱。這可能是因?yàn)樯鲜霪煼ú⑽聪凉撛诘尿?qū)動(dòng)β細(xì)胞破壞的T細(xì)胞相關(guān)記憶。或許，多途徑療法或聯(lián)合治療能夠達(dá)到長期緩解疾病的目的。而長期、持續(xù)性免疫抑制療法必然不是治療1型糖尿病的選擇。

大約每300個(gè)隨機(jī)選擇的遺體捐獻(xiàn)者中就有1人表達(dá)多種胰島自身抗體，因此可能約有一百萬美國人正處在1型糖尿病的發(fā)展過程中。隨著免疫調(diào)節(jié)/免疫抑制療法的改進(jìn)，或抗原特異性治療的發(fā)展，我們相信慢性活動(dòng)性胰島炎可能會(huì)像慢性活動(dòng)性肝炎一樣成為可治療的病變。