IκBα、IKKα、IKKβ與Tim-3在腫瘤患者中表達及相關性研究

楊子彬 李善華 張龍飛 馮俊霞 李合華

核因子（NF）-κB是重要的轉錄調控因子，其廣泛存在于各種細胞中，參與免疫應激、細胞增殖、生長分化及細胞凋亡。NF-κB通常與其抑制蛋白IκB相結合，以非活性狀態儲存于細胞質中，只有當激活IκB激酶（IKK），水解IκB，解除了IκB的抑制作用，NF-κB才能進入細胞核中并與相應靶基因上的DNA序列（κB位點）結合，發揮基因轉錄功能。T細胞免疫球蛋白黏蛋白結構域相關分子-3（Tim-3）蛋白特異性表達于Th1細胞表面并參與自身免疫疾病的發病，也參與腫瘤免疫[1]。為進一步探討IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3在腫瘤患者體內之間的關系，本研究檢測了IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3 mRNA水平，并分析這些指標之間的相關性，報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2010年8月—9月在我院腫瘤內科接受化療的中晚期腫瘤患者32例（腫瘤組），男17例，女15例，平均（57.7±12.6）歲。其中肺癌16例，胃癌4例，乳腺癌2例，結腸癌3例，直腸癌、食管癌、肝癌、宮頸癌、膀胱癌、血管母細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤各1例。選擇同期在我院進行體檢的健康人群34例（對照組），其中男19例，女15例，平均（44.0±11.0）歲。2組性別構成差異無統計學意義（χ2=0.510，P>0.05），腫瘤組年齡大于對照組，差別有統計學意義（t=4.147，P<0.01）。

1.2 儀器和試劑 實時定量PCR儀（ABI 7300）、臺式高速離心機（Sigma），TRIzol總RNA提取試劑、Quant cDNA第一鏈合成試劑盒及Real Master Mix（SYBR Green）（北京天根生化科技有限公司）、人淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限公司）。

1.3 引物設計 根據文獻[2]設計IκBα、IKKα和IKKβ的引物 。IκBα：上游 5′-GCAAAATCCTGACCTGGTGT-3′ ，下游5′-GCTCGTCCTCTGTGAACTCC-3′；IKKα：上游5′-AAACCA GAAAATTGTTGTGGACTTAA-3′，下游5′-ATCGAATCCCAG ACCCTATATCAC-3′；IKKβ：上游5-CCGACAGAGTTAGCAC GACA-3′，下游5′-GGCAATCTGCTCACCTGTTT-3′。Tim-3引物由天津潤泰科技發展有限公司設計，上游5′-TCTTTGGCCA ACCTCCCTCCCT-3′，下游5′-TGTGAGGGTTGCTGCC5TGC T-3′；內參照GAPDH引物：上游5′-AGCCGCATCTTCTTTT?GCGTCG-3′，下游5′-TGACCAGGCGCCCAATACGA-3′。

1.4 外周血淋巴細胞分離 采集空腹肘正中靜脈血2 mL，EDTA抗凝，利用人淋巴細胞分離液分離出淋巴細胞。PBS洗滌2遍備用。

1.5 RNA提取并反轉錄為cDNA 于淋巴細胞中加入1 mL TRIzo（l北京天根生化科技有限公司），破解細胞，加入氯仿，抽提水相中的總RNA；使用Quant cDNA第一鏈試劑盒按照說明書操作進行反轉錄：取上述總RNA 4 mL（約2 mg），Oli?go-dT15（10 mmol/L）2 mL，10×RT mix 2 mL，dNTP 混合液（2.5 mmol/L）2 mL，Quant Reverse Transcriptase 1 mL，無酶水9 mL，總計20 mL；徹底混勻，37 ℃ 1 h。

1.6 實時定量PCR 20 mL PCR反應體系：上述cDNA 1 mL，上下游引物各1 mL，2.5×Real Master Mix/20×SYBR solution 9 mL，無酶水8 mL；實時定量PCR反應條件：94℃1 min預變性，94℃ 20 s變性，58℃ 15 s復性，68℃ 30 s延伸，重復40個循環。△Ct=Ct目的基因-CtGAPDH后，計算出標準化的2-△Ct值。

1.7 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統計處理，正態分布資料采用±s表示，行t檢驗，非正態分布采用中位數和四分位間距M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗（Wilcox?on法），相關分析采用Spearman等級相關，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3表達水平比較 腫瘤組IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3表達水平均低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01），見表1。

表 1 2組IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3表達水平比較M（P25，P75）

2.2 腫瘤患者IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3之間的相關性分析 IκBα、IKKα、IKKβ及Tim-3之間均呈正相關（P<0.01），見表2。

表2 腫瘤患者4項指標之間的相關系數 （rs）

3 討論

IκBs作為NF-κB的的抑制蛋白，能和NF-κB的核定位信號域結合，從而抑制NF-κB的活性。IκBα是IκBs的最主要成員之一，是NF-κB的主要調控蛋白[3]。IKK是IκB的激酶，主要由IKKα、IKKβ和IKKγ組成。其中IKKα、IKKβ具有激活IκB的功能，而IKKγ不含催化激酶結構，沒有激活IκBα的功能。IKKβ/NF-κB途徑稱為經典途徑，而IKKα/NF-κB途徑稱為旁路途徑。IKKα和IKKβ對IκB激活作用是以IKKβ為主要成分[3]。多數惡性腫瘤發病與IKK途徑被激活有關。本研究結果顯示腫瘤患者的IκBα、IKKα、IKKβ mRNA表達均低于對照組，并且IκBα與IKKα、IKKβ相關系數分別是0.418和0.729，說明IκBα主要是由IKKβ激活。IKKα也參與了IκB激活，形成腫瘤，與文獻[4]有相同的認識。

Tim基因家族有調節Th1和Th2細胞介導的免疫應答作用。Tim-3蛋白特異性表達于Th1細胞表面，可以作為區分Th1和Th2細胞的標志，有抑制Th1細胞免疫功能的作用并參與腫瘤免疫[1]。Tim基因家族蛋白是炎癥關鍵調控因子。在Th1細胞介導的免疫應答中，Tim-3分子通過和Tim-3配體（Galectin-9，Tim-3L）相互作用而發揮作用。Tim-3在腫瘤免疫中通過Galectin-9促進樹突狀細胞（DC）的成熟來增強免疫應答[5]，通過活化巨噬細胞等途徑間接激活T細胞[6]。但也有人認為可溶性Tim-3能顯著降低T細胞的抗腫瘤免疫，具有負性調節作用[7]。Tim-3表達量的升高會抑制機體的抗腫瘤能力，促進黑色素瘤的發展[8]。本研究結果顯示腫瘤患者的 Tim-3 mRNA 較對照組降低，且 Tim-3與 IκBα、IKKα、IKKβ均呈正相關。提示腫瘤患者的免疫功能與IKKα的相關性更為密切，Tim-3在腫瘤患者中發揮著正性調節作用[8]。

[1]劉津麟，周南進.Tim-3/Tim-3L與腫瘤免疫的關系[J].江西醫藥，2009，44（10）：1036-1039.

[2]李治琴，鄭一君，陳曉微，等.IKKα/β、IκBα-mRNA在系統性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞中的表達及臨床意義[J].臨床皮膚科雜志，2010,39（3）：148-150.

[3]崔篙，劉學鋒，吳斌.NF-κB在腫瘤中的研究進展[J].現代腫瘤學,2009,17（1）：134-137.

[4]高文信，莫珩，呂曉麗，等.金地鼠頰囊癌變過程中p65和IKKα表達的實驗研究[J].口腔醫學研究，2005,21（1）：31-34.

[5]Nagahara K，Arikawa T，Oomizu S，et al.Galeetin-9Increases Tim-3-dendritic cells and CD8T cells and enhances antitumor im?munity via galeetin-9-Tim-3 interactions[J].J lmmunol，2008，181(11)：7760-7769.

[6]許朝旭，張桂梅，黃波，等.膜型Tim-3分子促進荷瘤小鼠抗腫瘤免疫應答的研究[J].醫學分子生物學雜志，2007,4（3）：200-203.

[7]Geng H，Zhang GM，Li D，et al.Soluble form of T cell Ig mucin 3 is an inhibitory molecule in T cell-mediated immune response[J].J Immunol，2006，176(3)：1411-1420.

[8]Wiener Z，Kohalmi B，Pocza P.TIM-3 is expressed in melanoma cells and is upregulated in TGF-beta stimulated mast cells[J].J In?vest Dermatol，2007，127(4)：906-914.