桂皮醛誘導K562細胞分化增強Mel18表達

劉黎瓊 劉 澤林 王 欣 王 淡瑜 崔 海燕 金夢迪

惡性腫瘤的誘導分化治療已成為目前腫瘤生物學和腫瘤治療學的前沿領域和研究熱點，尤其是中藥提取物的誘導分化研究是熱點中的熱點。桂皮醛是食用香料肉桂提取物的主要活性成分，具有安全無毒特點。桂皮醛可對多種惡性腫瘤調亡發揮抑制增殖、誘導凋亡的效應，我們的前期研究也顯示桂皮醛可誘導慢性粒細胞性白血病細胞株K562凋亡，但尚無桂皮醛誘導分化效應研究的報道［1－3］。本實驗觀察桂皮醛誘導K562細胞分化改變及探討相關機制，以進一步研究桂皮醛抗腫瘤的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與主要試劑 人慢性髓細胞白血病細胞株K562來自華中科技大學同濟醫學院協和醫院干細胞研究與應用中心保存。桂皮醛(分子式C9H8O，分子量132.16，純度大于95%，購自上海國藥集團化學試劑有限公司)，用二甲基亞砜配成貯存液。藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)標記的抗人CD11b單克隆抗體(CD11b-PE)、異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocynate，FITC)標記的抗人CD14抗體(CD14-FITC)購自美國 BD(Becton，Dickinson and Company)公司。兔抗人Mel18多克隆抗體、FITC標記的羊抗兔IgG多克隆抗體(IgG-FITC)購自Santa Cruz公司。兔抗人c-Myc多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自Cell signaling公司。

1.2 細胞培養與分組 K562細胞用RMPI 1640完全培養液在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，每2～3天傳代一次，取對數生長期細胞用于實驗(要求細胞活性＞98%)。實驗組加入桂皮醛使終濃度分別為30 μmol/L和60 μmol/L，對照組加入等體積含二甲基亞砜的RPMI 1640(二甲基亞砜濃度與實驗組相同，均 ＜0.1%)，繼續培養24 h。

1.3 流式細胞術

1.3.1 細胞分化檢測:收集各組細胞，充分洗滌后，加入CD11b-PE和CD14-FITC標記，PBS洗后重懸，上流式細胞儀檢測。數據經CellQuest軟件進行分析。

1.3.2 Mel18表達檢測:收集各組細胞，固定，破膜，加入兔抗人Mel18單抗(一抗)，孵育，洗滌后加入羊抗兔 IgG-FITC標記(二抗)，上流式細胞儀檢測。數據經CellQuest軟件進行分析。

1.4 Western blot檢測 收集各組細胞，提取細胞總蛋白，凝膠分離、轉膜、免疫雜交。一抗為兔抗人c-Myc抗體或兔抗GAPDH抗體，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG。充分漂洗后在化學放光試劑中反應，暗房曝光后沖洗膠片、掃描，輸入計算機。

1.5 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 桂皮醛對K562細胞表面分化抗原的影響 經30 μmol/L和60 μmol/L桂皮醛處理24 h后，K562細胞表面單核細胞分化抗原CD11b和CD14表達率增加，并呈濃度依賴性改變，與對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。這提示桂皮醛誘導K562細胞向單核細胞方向分化。

表1 桂皮醛誘導K562細胞分化抗原表達n=3，%，±s

表1 桂皮醛誘導K562細胞分化抗原表達n=3，%，±s

注:與對照組比較，*P ＜0.01

組別 CD11b陽性率 CD14 2.9 ±0.6 2.3 ±1.3實驗組30 μmol/L 10.9 ±1.3* 8.7 ±1.3*實驗組60 μmol/L 75.7 ±2.3* 84.1 ±3.5陽性率對照組*

2.2 桂皮醛增強Mel18表達 K562細胞自身表達 Mel18，60 μmol/L桂皮醛處理24 h后，k562細胞Mel18平均熒光強度與對照相比明顯增加;見圖1。這提示桂皮醛誘導K562細胞分化伴Mel18表達增加。

2.3 桂皮醛降低c-Myc表達 經Western blot檢測結果表明，c-Myc在K562細胞陽性表達，經60μmol/L桂皮醛處理24 h誘導細胞分化后，c-Myc表達明顯下降。見圖2。

圖1 桂皮醛增強K562細胞Mel18表達

圖2 桂皮醛降低c-Myc表達

3 討論

白血病是造血干細胞的惡性克隆性疾病，白血病細胞增殖失控、凋亡和分化受阻，誘導白血病細胞凋亡和分化是目前白血病化學治療的主要方法。有報道證實，許多通過細胞毒方式殺傷白血病的藥物在低濃度時可誘導白血病細胞分化;多種傳統中藥的活性成分對白血病細胞同時有誘導凋亡和分化效應［4］。桂皮醛是食用香料肉桂提取物的主要活性成分，在癌癥防治方面具有重要作用，我們的前期工作發現較高濃度桂皮醛可誘導K562凋亡［3］。在本研究中，我們發現低濃度桂皮醛可誘導人白血病細胞K562分化，并表現為濃度依賴性。

癌基因激活和抑癌基因失活是各種腫瘤發生和演進的基礎，增強抑癌基因的表達和功能可抑制腫瘤生長、誘導腫瘤細胞分化和凋亡［5］。mel18為PcG基因家族成員，表達于正常乳腺組細胞和較成熟造血細胞［6，7］。研究發現，分化抑制因子1(inhibitor of differentiation Id1)可通過下調mel18表達進而上調原癌基因c-myc，有助于腫瘤發生［8］。增強mel18表達可抑制乳腺癌細胞株克隆形成和原癌基因c-Myc表達，我們既往研究顯示轉染外源性 mel18可抑制人白血病細胞U937生長［9，10］。以上結果顯示，mel18為一潛在抑癌基因。近來研究發現mel18在原代急性髓細胞白血病細胞也有廣泛表達［11］。因此，mel18在白血病中具體發揮何種作用尚不明確，值得進一步深入探討。本研究發現，人白血病細胞K562表達Mel18及c-Myc，桂皮醛誘導K562細胞分化同時增強Mel18表達和削弱c-Myc表達。這說明mel18雖然在白血病細胞中也有表達，但mel18表達增強仍有助于白血病細胞向成熟方向分化，發揮抑癌基因功能，Mel18表達增加可能是桂皮醛誘導K562細胞分化的重要機制之一，其具體調控機制有待進一步研究。

總之，桂皮醛可誘導白血病細胞分化，PcG基因家族成員mel18參與這一過程，發揮抗白血病效應。這為桂皮醛對白血病的作用及其機制研究提供了新的理論參考依據，并為mel18在白血病中作用的研究提供了前期實驗基礎。

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