過氧化物酶體增殖激活受體γ或α在改善HepG2細胞糖代謝中的作用

宋璐璐 ，蕭建中，邢小燕 ，張 敏，楊文英*

（1.北京協和醫學院 研究生院，北京 100730；2.中日友好醫院 內分泌與代謝病中心，北京 100029；3.北京大學醫學部 研究生院，北京 100091）

過氧化物酶體增殖激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors，PPAR）家族是一組經典的核受體，參與細胞能量代謝、炎癥、增殖及分化的控制，尤其是糖脂的代謝。其中PPAR-α和PPAR-γ與代謝的關系更為密切。PPAR-γ主要在脂肪組織表達，也在肝臟、骨骼肌、胰腺及其它組織低表達[1]。主要調節脂質儲存，促進糖代謝，抑制炎癥及誘導脂聯素的合成與分泌[2]。PPAR-α主要在脂代謝活動旺盛的組織表達，如肝臟、脂肪、肌肉等[3]，是脂肪酸氧化的調節元件，參與脂肪酸代謝的調控，增加脂肪酸線粒體攝取和β氧化的基因表達，并且促進肝臟糖原合成和酮體的生成，參與脂蛋白的組裝。在心臟，PPAR-α還參與糖脂代謝轉換的調控[4]。

關于PPAR-γ或PPAR-α在人肝細胞糖代謝中所扮演的角色，尚缺乏直接的證據。HepG2細胞是一種常用的肝癌細胞株，兼具肝細胞和腫瘤細胞的特征，能夠表達多種肝臟特異的功能，因此被用于研究肝細胞生理或者作為肝細胞代謝研究的體外模型，也是生物人工肝的細胞源之一，本研究探討PPAR-α和PPAR-γ受體在HepG2細胞糖代謝調節中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

WY14643，吡格列酮和棕櫚酸購自美國Sigma公司；牛血清白蛋白（不含游離脂肪酸）購自德國Cabiochem公司；葡萄糖測定試劑盒（北京康泰臨床檢驗試劑）；丙酮酸測定試劑盒和乳酸測定試劑盒 （南京建成生物科技有限公司）；Trizol（Invitrogen，美國），Real time-qPCR 試劑盒（Toyobo，日本）。WY14643和吡格列酮溶于二甲基亞砜，棕櫚酸按6.8：1的比例與不含游離脂肪酸的牛血清白蛋白共軛耦合。

1.2 細胞培養

HepG2細胞在5%C02、37℃條件下培養于含10%胎牛血清、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、青霉素、鏈霉素和1g/L葡萄糖的DMEM培養基。細胞復蘇傳至第3代后進行分組實驗。

1.3 葡萄糖消耗實驗

以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化細胞，將細胞懸液接種于96孔培養板，細胞生長至70%～80%密度后更換為含胰島素（10-7M）的無血清無酚紅低糖（1g/L）DMEM培養基，分別加入吡格列酮（10μM），WY14643（10μM），每組設 6 個平行孔，每孔100μl培養基，孵育24h后以葡萄糖氧化酶法測定培養基上清中葡萄糖濃度，計算絕對葡萄糖消耗量。然后每孔加入20μl MTT試劑，37℃孵育4h，DMSO充分溶解后測定吸光度，以此代表細胞活力，計算相對葡萄糖消耗量（絕對葡萄糖消耗量/細胞活力）。

1.4 胰島素抵抗（IR）模型

IR的細胞模型建立參照文獻[5]。HepG2細胞生長至50%～60%融合，更換含高濃度FFA（0.5 mmol／L）的低糖 DMEM 培養基培養24h，于4℃條件下用預冷0.01mol／L磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞3次，即成為具有IR的細胞模型，測定培養液中葡萄糖含量作為模型鑒定指標。模型建立后，分別用吡格列酮（10μM），WY14643（10μM），測定胰島素刺激后的葡萄糖消耗量。

1.5 糖酵解產物測定

細胞種于96孔板，24h后無血清無酚紅無丙酮酸鈉的低糖DMEM培養基，分別加入吡格列酮（10μM），WY14643（10μM），繼續孵育 24h，檢測培養基中丙酮酸和乳酸含量。另外將細胞種于12孔板，每組設6個平行孔，給予藥物處理24h后，以胰酶收獲各瓶中全部細胞。離心，僅保留細胞沉淀，加入低滲鹽溶液，使各樣品細胞終濃度均為1×106／m1，反復凍融3次，用超聲波振蕩器處理1min，離心后保留上清，測定丙酮酸和乳酸含量。

1.6 總RNA提取和RT-qPCR

細胞種于12孔板，分別給予不同藥物處理24h后，收集細胞提取總RNA。將1g總RNA，65℃變性5min，反轉錄得到cDNA，進行實時熒光定量PCR，檢測糖酵解相關基因醛縮酶（ENO1），磷酸果糖激酶（PFKL），磷酸甘油酯激酶（PGK1）和丙酮酸激酶（PKM2）的mRNA表達。采用NCBI在線引物設計軟件設計引物，序列如下：PPAR-γ正義引物5'-CAG CCA CCC ACT GTT CAT CAT-3'，反義引物5'-CGG AAT GCA CCA TGC ACT T-3'；PPAR-α 正義引物 5'-ATG GGT ATT GGT CCT GTC CCT-3'，反義引物5'-TCC TGC TTT CTT CAG TGC CC-3'；ENO1正義引物 5'-GCT CTA GCT TTG CAG TCG TG-3'，反義引物5'-TGA GGC GAG AAA AAC AAT GA-3'；PFKL 正義引物 5'-GTCCGCAGCACTCAGACTACG-3'，反義引物5'-GTT GTT GCT GAT GGT GGC TG-3'；PGK1正義引物 5'-AGC CCA CAG CTC CAT GGT AG-3'，反義引物5'-TCA AAA ACC CAC CAG CCT TCT'；PKM2 正義 引物 5'-GCCATGGCTGACACATTCCT-3'，反義引物5'-TGAATCAATGTCCAGGCGG-3'。Real-Time PCR條件：95℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 45s，40 個 循環，以GAPDH作為內參照。

1.7 數據處理

所有數據采用SPSS11.5軟件統計，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 吡格列酮和WY14643對PPAR-γ或PPAR-α表達的影響

吡咯列酮組PPAR-γmRNA表達與對照組相比增加7%，無統計學差異。WY14643組PPAR-α表達輕度減低（11%），無統計學差異。

2.2 吡格列酮和WY14643均增加葡萄糖消耗

各實驗組經細胞活力測定校正后，吡格列酮組HepG2細胞葡萄糖消耗量增加了150%（P＜0.01），WY14643 組增加了 20%（P＜0.05）。

圖1示，IR模型組HepG2細胞葡萄糖消耗量較正常組明顯減少，約為正常組的40%（P＜0.01），吡咯列酮明顯增加葡萄糖的消耗，較模型組增加 1.4 倍（P＜0.01），WY14643 組葡萄糖消耗量較模型組增加 45%（P＜0.05）。

2.3 PPAR-γ對HepG2糖酵解基因表達的調控

HepG2細胞糖代謝以糖酵解途徑為主，因此我們檢測了4個糖酵解相關基因。圖2示，吡格列酮顯著上調PFKL、PGK1和PKM2的表達，分別比對照組增加7.7倍、4.5倍和4.2倍（P＜0.05）；WY14643處理組，ENO1和PKM2基因表達輕度上調，但沒有統計學差異。

2.4 吡格列酮、WY14643對糖酵解的影響

圖3示，吡格列酮處理后，相比空白組，培養液上清中丙酮酸水平和乳酸水平分別升高了69%和120%，細胞內丙酮酸水平和乳酸水平分別提高了72%和89%，細胞內和細胞外糖酵解產物水平變化一致。WY14643對細胞內及細胞外丙酮酸和乳酸水平均無顯著影響。

3 討論

PPAR-α和PPAR-γ擁有許多共同的靶點，也有各自獨立調控的基因群。動物實驗中，噻唑烷二酮增強多個靶器官的胰島素敏感性，上調肝臟胰島素信號轉導通路的基因表達，減輕胰島素抵抗，并減少肝糖輸出。體外研究發現，HepG2表達PPAR-γ，PPAR-γ 激動劑多對 PPAR-γmRNA 的轉錄水平沒有顯著影響，與本研究的結果一致；其主要效應表現為強烈誘導PPAR-γ活化[6，7]。

本研究觀察了 PPAR-α和 PPAR-γ在HepG2細胞糖代謝中扮演的角色。PPAR-α激動劑和PPAR-γ激動劑都增加HepG2細胞葡萄糖的消耗量，并且不同程度地改善游離脂肪酸誘導的胰島素抵抗；吡格列酮部分通過上調糖酵解相關基因增加葡萄糖消耗，而WY14643并調節HepG2糖酵解。

PPAR-γ激動劑增加糖酵解產物丙酮酸和乳酸生成。糖酵解是HepG2細胞糖代謝的起點，因此直接影響其他代謝途徑的調控[8]。丙酮酸和乳酸水平升高有可能有3種機制：葡萄糖攝入增加，糖酵解增強以及糖酵解利用減少。本研究中吡格列酮促進HepG2葡萄糖的消耗，Kim等[9]人報道TZDs上調原代培養的肝細胞GLUT2基因表達，增加葡萄糖的攝取。本研究檢測了糖酵解相關基因的表達，發現PPAR-γ激動劑至少上調3種參與糖酵解的基因表達，表明PPAR-γ激動劑也促進HepG2細胞糖酵解。

PPAR-α主要和脂質代謝有關，動物實驗發現PPAR-α激動劑能夠改善胰島素抵抗，降低血糖[10，11]，但在臨床研究中沒有得到同樣的結果[12]。本研究表明，激動劑輕度增加HepG2細胞葡萄糖消耗，并改善胰島素抵抗，但對糖酵解基因的誘導和糖酵解途徑的激活沒有作用。PPAR-α激活可能調節葡萄糖攝取或其他代謝途徑，有文獻報道PPAR-α激動劑GW7467促進大鼠心肌細胞葡萄糖的攝取[13]。

PPAR-γ和PPAR-α在肝細胞及心肌細胞的作用與在脂肪細胞的作用完全不同。羅格列酮對分化成熟的人脂肪細胞GLUT4表達無明顯作用，對其糖攝取和糖酵解的影響也無統計學差異[4]。而PPAR-α抑制分化成熟的脂肪細胞糖酵解，減少丙酮酸和乳酸生成，抑制糖酵解相關基因的表達；抑制葡萄糖的攝取[4]。這與在HepG2細胞中得到的結果完全不同。

綜上所述，本研究發現在HepG2細胞PPAR-γ和PPAR-α受體都有促進糖代謝的作用，并且可不同程度地改善棕櫚酸誘導的胰島素抵抗，其作用機制可能與增強葡萄糖攝取或糖酵解有關。關于PPAR-γ和PPAR-α在正常肝細胞糖代謝中的作用有待進一步探討。

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