祛痰止咳顆粒指紋圖譜研究*

鄭文燕，王曉東，彭 維，沈 藝，蘇薇薇

(1.中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275；2.廣州市花城制藥廠，廣東 廣州 510555)

祛痰止咳顆粒是廣州市花城制藥廠獨家生產的國家中藥保護品種，具有健脾燥濕、祛痰止咳的功效；主要用于慢性支氣管炎及支氣管炎合并肺氣腫、肺心病所引起的痰多，咳嗽，喘息等癥。該顆粒是由《傷寒論》和《金匱要略》中的參夏湯與十棗湯化裁而來[1]，主要由紫花杜鵑、黨參、芫花、甘遂、水半夏五味藥材組成。筆者首次建立了祛痰止咳顆粒的指紋圖譜質量控制方法，解決原質量標準無法全面控制該產品質量的瓶頸問題，并將該項指紋圖譜技術應用于生產實踐，監控成品質量。

1 儀器與試藥

Dionex P680高效液相色譜儀(美國戴安公司，ASI-100自動進樣器、ATH-585柱溫箱、四元梯度泵、PDA-100檢測器)及Chromeleon工作站；Agilent高效液相色譜-質譜聯用儀(Agilent 1200RRLC-6410三重四級桿串聯質譜儀)；BP211D電子分析天平(瑞士沙多利斯公司)；T660/H超聲波清洗器(美國埃瑪公司)。

金絲桃苷(批號：111521-200303)、槲皮苷(批號：111538-200403)、槲皮素(批號：100081-200406)、木犀草素(批號：111720-200603)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；芹菜素(批號：20090304)、芫花素(批號：90007586)對照品分別購自天津尖峰天然產物研究開發有限公司和阿法埃莎化學有限公司；12批祛痰止咳顆粒由廣州市花城制藥廠提供。

甲醇 (美國Burdick & Jackson) 為色譜純；甲醇(廣東光華化學廠有限公司)、冰醋酸(天津市富宇精細化工有限公司)均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取金絲桃苷、槲皮素、木犀草素對照品各1mg，槲皮苷、芹菜素、芫花素對照品各2 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含金絲桃苷、槲皮素、木犀草素各0.1 mg，含槲皮苷、芹菜素、芫花素各0.2 mg的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取祛痰止咳顆粒10袋，研細，取約16 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率360 W，頻率35 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液50 mL，減壓回收溶劑至干，殘渣加水約5 mL溶解，定量轉移至固相萃取小柱(填料：C18，規格：6 mL,500 mg)，加水20 mL分次淋洗，淋洗液棄去，再用甲醇20 mL分次洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑至干，殘渣定量加入甲醇2 mL，使完全溶解，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得祛痰止咳顆粒供試品溶液。紫花杜鵑、芫花等5味藥材按處方比例折算，稱取粉末，分別制成單味藥材供試品溶液以及陰性缺味的供試品溶液，同法處理。

2.2 色譜條件

依利特 Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；以甲醇為流動相A，以φ=0.15%冰醋酸溶液為流動相B，線性梯度洗脫：0～95 min，A(15%→75%)；流速為1 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫為25 ℃；進樣量：20 μL。理論塔板數按以芹菜素計算不低于9 000。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 按“供試品溶液的制備”方法制備祛痰止咳顆粒供試品溶液(批號：090308)，連續進樣6次，記錄HPLC色譜圖，以保留時間64 min峰面積較大、較穩定的色譜峰(17號峰)芹菜素作為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果各共有峰的相對保留時間RSD為0.04%～0.80%,相對峰面積的RSD為1.06%～2.00%；采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》進行評價，相似度大于0.999，表明儀器精密度好。

2.3.2 穩定性考察 按“供試品溶液的制備”方法制備祛痰止咳顆粒供試品溶液(批號：090308)，分別在0、2、4、6、8、10、24 h進樣分析，記錄HPLC色譜圖，以芹菜素色譜峰為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果各共有峰的相對保留時間RSD為0.01%～0.88%,相對峰面積的RSD為1.13%～2.08%；采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》進行評價，相似度大于0.999，表明供試品溶液在放置24 h內穩定性好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批祛痰止咳顆粒(批號: 090308)，按“供試品溶液的制備”方法平行操作，制備6份祛痰止咳顆粒供試品溶液，分別進樣分析，記錄HPLC色譜圖，以芹菜素色譜峰為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果相對保留時間的RSD為0.05%～0.16%，相對峰面積的RSD為1.12%～2.69%；采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》進行評價，相似度大于0.999，表明該方法重復性好。

2.4 祛痰止咳顆粒指紋圖譜的構建及相關技術參數

2.4.1 指紋圖譜的構建 取12個批號的祛痰止咳顆粒供試品溶液，按“2.2”項下的色譜條件進行測定，將12批成品的數據采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004 A版》進行評價，確定19個共有峰并獲得共有模式(參照指紋圖譜)見圖1。結果表明12批祛痰止咳顆粒的相似度均大于0.90，證明祛痰止咳顆粒的生產工藝穩定，產品的均一性較好，結果見圖2及表1。

表1 12批祛痰止咳顆粒相似度評價表

圖1 祛痰止咳顆粒的HPLC參照指紋圖譜

圖2 12批祛痰止咳顆粒相似度評價結果圖

2.4.2 共有峰的標定及藥材歸屬 分別精密吸取單味藥材及陰性缺味供試品溶液，注入液相色譜儀，采集色譜圖。通過對比分析，19個共有峰中，歸屬于君藥紫花杜鵑的色譜峰有3個，分別為第7、11、15號峰；歸屬于臣藥芫花的色譜峰應有7個，分別為第6、8、9、12、15、17、19號峰；歸屬于甘遂的色譜峰應有3個，分別為2、4、5號峰，其中2號峰為黨參和甘遂的共有峰；1號峰為所有藥材的共有峰。同時，在此分析條件下，水半夏成分峰在圖譜上沒有體現，結果見圖3、4、5。

2.4.3 色譜峰的定性分析

1) 對照品對照法 取金絲桃苷、槲皮素、木犀草素、槲皮苷、芹菜素、芫花素的混合對照品溶液及祛痰止咳顆粒供試品溶液適量，按“2.2”項色譜條件進樣分析，采集色譜圖，根據色譜峰的保留時間定位以及化學成分的PDA光譜圖信息對比，確定7號峰、11號峰、14號峰、15號峰、17號峰、19號峰分別為金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素、芫花素，結果見圖6。

圖3 祛痰止咳顆粒指紋圖譜、紫花杜鵑藥材色譜圖及缺紫花杜鵑陰性色譜圖

圖4 祛痰止咳顆粒指紋圖譜、芫花材色譜圖及缺芫花陰性色譜圖

圖5 祛痰止咳顆粒指紋圖譜、甘遂材色譜圖及缺甘遂陰性色譜圖

圖6 混合對照品圖與標準指紋圖譜

2) LC-ESI-MS/MS成分鑒別 采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×50 mm，1.8 μm)柱，甲醇-0.15%(φ)冰醋酸溶液作為流動相，對祛痰止咳顆粒色譜成分進行分析。ESI-MS/ MS參數：干燥氮氣溫度350 ℃，流量13.0 L/min，霧化器壓力40 psi，毛細管電壓4 000 V，掃描質量范圍m/z 100～1 000。黃酮類化合物中的羥基容易形成穩定的氧負離子，故用負離子模式檢測有較好的信噪比。通過質譜的分子離子峰、裂解碎片，結合紫外吸收光譜特征，相關文獻[2-7]以及對照品對照，對顆粒中的色譜峰進行歸屬，確證6個化學成分，指證4個化學成分，結果見表2。

表2 祛痰止咳顆粒化學成分質譜歸屬

*為有對照品對照

3 討 論

1) 本研究首次構建了祛痰止咳顆粒高效液相(HPLC)指紋圖譜，采用二元線性梯度洗脫，在波長260 nm下檢測出19個共有色譜峰。在此色譜條件下，能同時檢出祛痰止咳顆粒中紫花杜鵑、芫花、甘遂、黨參四味藥材，歸屬于紫花杜鵑的色譜峰有3個，歸屬于芫花的色譜峰有7個，歸屬于甘遂的色譜峰有3個，歸屬于黨參的色譜峰有1個 ，該峰與甘遂共有。其中，紫花杜鵑和芫花分別為方中的君藥和臣藥，藥效學表明黃酮類成分為這兩味藥鎮咳化痰的有效成分，在該方法下能同時檢出歸屬于芫花和紫花杜鵑藥材的10個黃酮類成分，解決原質量標準無法全面控制該產品質量的瓶頸問題，為成品的內在質量提供了強有力的保障。

2) 采用HPLC-ESI/MS/MS及HPLC-PDA對祛痰止咳顆粒圖譜中的色譜峰進行分析，通過質譜的分子離子峰、裂解碎片，結合紫外吸收光譜特征，與對照品對照，鑒定出指紋圖譜中的10個化學成分：峰確證6個化學成分，分別為金絲桃苷、槲皮苷、芫根苷、槲皮素、木犀草素、芹菜素、芫花素；指證4個化學成分，分別為芹菜素-7-O- β-D-葡萄糖醛酸苷、芫根苷、椴苷、羥基芫花素；采用歸一化法對12批成品指紋圖譜中的共有特征峰進行統計，已知成分的色譜峰面積之和占共有色譜峰面積總和的66%以上。

參考文獻：

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