雙水相體系萃取木瓜蛋白酶的研究

樂 薇，陸志強

(中南民族大學工商學院 環境與生命科學系，湖北 武漢 430065)

木瓜蛋白酶是從木瓜的乳汁中提取精制而成的純天然酶制品，能將大分子蛋白質水解成肽或氨基酸，可制成肉類嫩化劑，具有助消化、消炎、利膽、止痛等藥效，應用范圍廣泛[1～3]。雙水相萃取條件溫和，成品活性損失小，處理量大，分離步驟少，無有機溶劑殘留，設備投資省，操作簡單，易于工程放大和連續操作[4～6]。

鑒于此，作者在此采用雙水相體系萃取木瓜蛋白酶，對萃取過程的主要影響因素進行研究，以期尋找有效的萃取高活性木瓜蛋白酶的方法。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

硫酸銨、95%乙醇、85%磷酸，分析純，天津市凱通化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉，分析純，天津市塘沽區德華化學試劑廠；三氯乙酸，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉，分析純，上海化學試劑公司；PEG4000，化學純，天津市光復精細化工廠研究所；干酪素，生化試劑，北京博星生物技術有限公司；L-酪氨酸，北京華綠淵生物有限公司；鹽酸半胱氨酸鹽、考馬斯亮藍G-250、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白，武漢貝寧生物技術公司。

752型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；PHS-25型數字酸度計，上海理達儀器廠；HH-2型數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雙水相體系萃取木瓜蛋白酶

配制一定pH值的一系列PEG/(NH4)2SO4雙水相溶液，分別加入相同體積的原酶液，室溫下在漩渦混勻器上混合3 min后，靜置30 min，待其自然成相后，使體系上下相分離完全。測定上下相體積、下相蛋白質的含量及酶活力，依酶活力回收率及總蛋白分配系數選擇適宜相對分子量的PEG進行后續實驗，考察其質量分數及pH值對木瓜蛋白酶萃取的影響。酶活力回收率及總蛋白分配系數依下式計算：

酶活力回收率=下相酶活力/原酶液酶活力

總蛋白分配系數=下相總蛋白濃度/上相總蛋白濃度

1.2.2 相圖的繪制

準確稱取質量分數為40%的PEG4000原液于試管中，加入質量分數為40%的(NH4)2SO4原液，混合，直至出現渾濁為止，計量加入(NH4)2SO4的量；再計量加入適量水，使體系澄清；并繼續加入(NH4)2SO4，使體系再次變渾濁；如此反復操作，按下式計算達到渾濁時PEG4000和(NH4)2SO4在系統中的質量分數，繪制PEG4000/(NH4)2SO4雙水相體系的相圖。

式中：P為某成相點時PEG4000在系統中的總量(g)；Q為某成相點時硫酸銨在系統中的總量(g)；W為某成相點時水在系統中的總量(g)；X為某成相點時PEG4000占總量的百分數(%)；Y為某成相點時硫酸銨占總量的百分數(%)。

1.3 蛋白質含量的測定[7]

以牛血清白蛋白作為標準，參照考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量。

1.4 酶活力的測定[1]

取適量待測酶液，加入0.25 mL激活劑(0.1 mol·L-1pH值7.2的磷酸緩沖溶液，含36 mmol·L-1半胱氨酸、0.6 mmol·L-1EDTA)和2.3 mL 0.1 mol·L-1pH值7.2的磷酸緩沖溶液，于37℃預熱10 min；加入37℃預熱的1%酪蛋白溶液0.5 mL，37℃下恒溫水浴反應10 min；然后加入1.0 mL 20%三氯乙酸溶液終止酶反應。對照管先加20%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它與測定管相同。過濾，取其上清液于波長275 nm處測定吸光度。

酶活力單位定義：37℃下，木瓜蛋白酶水解酪蛋白每分鐘產生1 μg酪氨酸的酶量定義為一個酶活力單位(U)。

2 結果與討論

2.1 PEG相對分子量對木瓜蛋白酶萃取效果的影響

固定PEG質量分數為8%、(NH4)2SO4質量分數為20%，考察PEG相對分子量對木瓜蛋白酶萃取效果的影響，結果見圖1。

圖1 PEG相對分子量對木瓜蛋白酶萃取效果的影響

由圖1可知，隨著PEG相對分子量的增加，木瓜蛋白酶的分配系數和酶活力回收率均呈下降趨勢。其中PEG2000和PEG4000相比，木瓜蛋白酶的分配系數和酶活力回收率差別不是很大，但從聚合物使用量和成本考慮，PEG分子量越低，成相所需(NH4)2SO4和PEG的質量分數就愈高，成本也就愈高。因此，確定采用PEG4000進行后續實驗。

2.2 雙水相相圖

按1.2.1繪制相圖，結果見圖2。

圖2 PEG4000/(NH4)2SO4雙水相相圖

由圖2可知，(NH4)2SO4和PEG4000質量分數達到一定時才可以形成兩相，在節線的上方區域都可以形成雙水相，以下操作所選擇的點均在相圖上方。

2.3 PEG4000質量分數對木瓜蛋白酶萃取效果的影響

固定(NH4)2SO4質量分數為20%，考察PEG4000質量分數對雙水相體系萃取木瓜蛋白酶的影響，結果見圖3。

圖3 PEG4000質量分數對木瓜蛋白酶萃取效果的影響

由圖3可知，當(NH4)2SO4質量分數一定時，隨著PEG4000質量分數的增加，木瓜蛋白酶的酶活力回收率及分配系數也相應增大；但PEG4000質量分數大于6%時，酶活力回收率及分配系數反而下降。這是因為，當(NH4)2SO4質量分數一定時，隨著PEG4000質量分數的增加，系統遠離臨界點，有利于目標蛋白富集于其中一相；但當PEG4000質量分數增大到一定程度時，成相物質分子間的作用增大，相界面張力亦增大，系統粘度也會增大，溶質在相間的傳遞和在相內的擴散阻力大大增加，反而不利于目標蛋白分子進入此相。因此，確定PEG4000質量分數為6%。

2.4 (NH4)2SO4質量分數對木瓜蛋白酶萃取效果的影響

固定PEG4000質量分數為6%，考察(NH4)2SO4質量分數對雙水相體系萃取木瓜蛋白酶的影響，結果見圖4。

圖4 (NH4)2SO4質量分數對木瓜蛋白酶萃取效果的影響

由圖4可知，當PEG4000質量分數一定時，隨著(NH4)2SO4質量分數的增加，酶活力回收率及分配系數也相應增大；但(NH4)2SO4質量分數大于18%時，酶活力回收率及分配系數反而下降。這是因為，(NH4)2SO4質量分數對分配系數的影響主要表現在對相間電位和蛋白質疏水性的影響；(NH4)2SO4質量分數過高會影響蛋白質的表面疏水性，使酶產生鹽析作用，從而使分配系數下降。因此，確定(NH4)2SO4質量分數為18%。

2.5 pH值對木瓜蛋白酶萃取效果的影響

pH值會影響蛋白質在兩相中的分配行為。固定PEG4000質量分數為6%、(NH4)2SO4質量分數為18%，考察pH值對雙水相體系萃取木瓜蛋白酶的影響，結果見圖5。

由圖5可知，隨著pH值的增大，木瓜蛋白酶的酶活力回收率及分配系數先增大后減小，pH值為6.0時最有利于酶的萃取，酶活力回收率和分配系數均達到最大，分別為80.25%和8.1。因此，確定pH值為6.0。

圖5 pH值對木瓜蛋白酶萃取效果的影響

3 結論

采用PEG4000/(NH4)2SO4雙水相體系萃取木瓜蛋白酶，當PEG4000質量分數為6%、(NH4)2SO4質量分數為18%、pH值為6.0時，木瓜蛋白酶的萃取效果最好，酶活力回收率為80.25%，分配系數達8.1。

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