砂箱內土著柴油降解菌的生長條件優化及其降解性能初步研究

楊金鳳，陳鴻漢，曹冠楠，楊正禮

(1.中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所，北京 100081；2.中國地質大學(北京)水資源與環境工程北京市重點實驗室，北京 100083)

柴油在其加工及應用過程中導致土壤污染的問題已為全球所關注，據統計，柴油對土壤的污染最易發生在加油站地下儲油罐的泄漏[1，2]。目前對地下儲油罐的泄漏污染修復主要采取生物方法，并取得了一定的成果[3～5]。由于柴油組成的復雜性及其生物難降解性，有必要對柴油降解菌種進行篩選，為此，作者對從模擬修復柴油污染土壤的砂箱裝置中富集、分離得到的土著柴油降解菌進行了生長條件優化和降解能力初步評價，希望為合理控制和修復柴油污染土壤提供理論基礎。

1 實驗

1.1 菌株和培養基

從模擬修復柴油污染土壤的砂箱裝置中富集、分離、篩選出微生物菌株：B-1(微桿菌屬)、B-2(短波單胞菌屬)、B-3(Tetrathiobacterkashmirensis，將菌株B-3與GenBank數據庫中同源性較高的細菌模式株進行比較，其16S rDNA序列與Tetrathiobacterkashmirensis有較高的序列同源性，且經系統發育分析與菌株B-4的同源性為97%，綜合形態學特征、生理生化指標，將菌株B-3歸于假單胞菌屬)和B-4(假單胞菌屬)[6]。

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1000 mL，pH值7.2～7.4，121℃滅菌20 min。

LB液體培養基[7]：蛋白胨 10 g，酵母菌 5 g，NaCl 10 g，蒸餾水 1000 mL，pH值7.2～7.4，121℃滅菌30 min。

無機鹽培養基：K2HPO40.8 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，CaCl20.03 g，KH2PO40.2 g，FeSO4·7H2O 0.09 g，pH值7.2～7.4，蒸餾水 1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 環境因素對菌株生長影響的考察

分別從保存有菌株B-1、B-2、B-3、B-4的斜面培養基上挑取環菌接入無機鹽培養基內，培養溫度分別為10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、40℃，搖床轉速為165 r·min-1，采用光電比濁法測定OD值，篩選出菌株生長的最適溫度。

在各菌株最適溫度下，通過改變無機鹽培養基中的K2HPO4和KH2PO4的比例，使pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，搖床轉速為165 r·min-1，采用光電比濁法測定OD值，篩選出菌株生長的最適pH值。

1.2.2 菌株對柴油降解能力的考察

通過觀察菌株的表面形態特征[6]和分析各菌株整個培養期內不同溫度、pH值對其OD值變化的影響，選取菌株B-3(未見文獻對其降解性能進行評價)和菌株B-4(代表典型降解石油烴的細菌)考察其對柴油的生物降解能力。

1.3 分析與測試

1.3.1 菌株生長量的測定

由于細菌懸浮液的濃度與濁度成正比，以菌懸液在波長600 nm的OD值來表征細菌的生長情況，其OD值變化曲線即為菌株的生長曲線。在已接種的細菌斜面培養基上挑取環菌放入LB液體培養基內，然后將其置于30℃恒溫搖床上，165 r·min-1培養45 h。每間隔1 h取一次樣，在波長600 nm下測定其OD值。對細胞密度大的培養基進行適當稀釋后測定，以不加菌的LB培養液為空白對照。

1.3.2 培養液中殘余TPH(Total petroleum hydrocarbon)含量的測定

取10個磨口錐形瓶，各加入25 mL無機鹽培養基，分裝5 mL B-3菌液于前5個錐形瓶，分裝5 mL B-4菌液于后5個錐形瓶，在裝有B-3菌液的5個錐形瓶中分別加入0.2%(體積分數，下同)、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%柴油，置于30℃恒溫搖床上培養，轉速為165 r·min-1，培養3～5 d后，對培養基內的有機相進行預處理，在其中加入CH2Cl2，振蕩搖勻，以打破水包油乳液，靜置分層，取下部有機相，用無水Na2SO4過濾脫水，室溫氮吹至1 mL，由進樣口注射入氣相色譜儀測定培養液中的殘余TPH含量。以不接菌的30 mL無機鹽培養基作為空白對照。

柴油降解率(η)依下式計算：

式中：A0為對照培養液中殘余TPH含量；Ax為測試菌培養液中殘余TPH含量。

1.3.3 培養液中柴油的主要代表性正烷烴組分測定

用微量進樣器取1 μL經CH2Cl2預處理過的下部已脫水有機相，由進樣口注射入氣相色譜儀(美國Agilent6820型氣相色譜儀，HP-5柱，進樣口溫度200℃，FID檢測器溫度280℃，分流比5∶1，流速2 mL·min-1，載氣為N2)，具體升溫程序是：45℃保持1 min，其后以5℃·min-1的速度升至100℃保持1 min，再以8℃·min-1的速度升至275℃保持1 min，再以15℃·min-1的速度升至310℃保持2 min。實驗所用儲備液包括柴油中的主要代表性正烷烴組分為：壬烷(C9)、癸烷(C10)、正十二烷(C12)、正十六烷(C16)、十八烷(C18)、二十二烷(C22)和二十八烷(C28)。

2 結果與討論

2.1 菌株生長條件的優化

2.1.1 溫度對菌株生長的影響(圖1)

圖1 溫度對菌株生長的影響

從圖1可以看出，隨著培養溫度的升高，各菌株的OD值逐漸上升，說明各菌株長勢良好；當溫度升高到一定值時，OD值開始下降，只是下降幅度有所差異；菌株B-1和菌株B-2的最適培養溫度為30℃，菌株B-3和菌株B-4的最適培養溫度為25℃。值得注意的是，同一溫度(≤25℃)下，菌株B-3的OD值比其它菌株均要大，說明其在培養液中的適應能力強、生長良好；菌株B-4對高溫更敏感，當溫度從30℃升至40℃時，其OD值約下降了0.10。

2.1.2 pH值對菌株生長的影響[8，9](圖2)

圖2 pH值對菌株生長的影響

由圖2可以看出，隨著pH值的增大，各菌株的OD值緩慢升高，pH值為7.5時，OD值達到最大；pH值繼續增大，OD值開始下降，菌株的生長受到抑制。從圖2還可以看出，隨pH值的增大，菌株B-3的生長量變化較大，說明菌株B-3受pH值影響較大，但其OD值在pH值7.0～7.5之間相差不大。

4株菌株在溫度為25～30℃、pH值為7.0～7.5的條件下，生長最佳。

2.2 菌株對柴油的降解能力

2.2.1 菌株對不同初始體積分數柴油的降解能力比較

菌株B-3、B-4對不同初始體積分數柴油的降解率見表1。

表1 菌株B-3、B-4對不同初始體積分數柴油的降解率/%

從表1可以看出，在柴油初始體積分數為0.2%～1.5%時，菌株B-3的柴油降解率明顯較菌株B-4的高，尤其在柴油體積分數為1.5%時，降解率達到了60.98%，較菌株B-4的高出23.8%；但隨著柴油初始體積分數的增加，菌株B-3的柴油降解率下降明顯，在柴油初始體積分數為2.0%時，降解率僅為30.17%；菌株B-4在柴油初始體積分數為0.5%、1.0%時降解率較高，但從同一柴油初始體積分數下的降解率來看，B-3菌株基本上高于B-4菌株。這表明相同降解條件下菌株B-3的降解能力高于菌株B-4，是一株更加優勢的降解柴油菌株。

2.2.2 菌株對柴油組分的降解

對不同初始體積分數柴油不接種菌株和分別接種菌株B-3、B-4搖床培養3～5 d后測其殘余TPH含量的同時，利用氣相色譜儀進行柴油中主要代表性正烷烴組分濃度變化分析，結果見圖3。

a～e的柴油初始體積分數為：0.2%，0.5%,1.0%,1.5%,2.0%

從圖3可以看出，柴油初始體積分數較低(<1.0%)時，與空白樣品對照，兩菌株對殘余TPH中主要代表性正烷烴組分的降解都較為徹底；隨著柴油初始體積分數的增大，降解程度呈下降趨勢。當柴油初始體積分數為0.2%時，添加菌株B-3的樣品中C10以下的短鏈烴已經降解完全，而添加菌株B-4的樣品中還存在組分C12；當柴油初始體積分數為0.5%時，兩菌株對各主要代表性正烷烴組分均有降解，表現為各組分濃度都在降低，但僅有C22以上組分被降解完全；當柴油初始體積分數增至1.0%時，兩菌株對樣品的降解程度進一步降低，但添加菌株B-3的樣品中各主要代表性組分濃度降低的幅度要略大于添加菌株B-4的樣品；當柴油初始體積分數為1.5%時，添加菌株B-3的樣品各代表性正烷烴組分的濃度下降最大，C16以下的短鏈烴已降解完全，而添加菌株B-4的樣品由于柴油初始體積分數的增大，降解能力開始減弱，各代表性正烷烴組分的濃度降低較少。這說明菌株B-3比菌株B-4在降解柴油方面更有優勢，更說明菌株B-3的最適柴油初始體積分數為1.5%，此時其降解柴油能力最強；當柴油比例為2.0%時，兩菌株的降解能力都在減弱，與空白樣品對照，各代表性正烷烴組分濃度下降的程度基本一致，說明添加的柴油已超過微生物自身的耐受范圍，抑制了微生物對柴油的降解。

3 結論

對從模擬修復柴油污染土壤的砂箱裝置中篩選到的4株土著柴油降解菌進行了生長條件優化和降解性能初步評價，結果如下：

(1)通過分離、篩選得到的土著柴油降解菌株B-1、B-2、B-3、B-4在10～35℃范圍內均可生長，相應的最佳培養溫度分別為30℃、30℃、25℃、25℃，最適pH值為7.0～7.5。

(2)通過對菌株B-3、B-4的降解特性進行研究表明：不同初始體積分數柴油下，菌株B-3在降解柴油方面更有優勢，對柴油的降解率明顯較菌株B-4高，尤其在柴油初始體積分數為1.5%時達到了60.98%，比菌株B-4高出23.8%；隨著柴油初始體積分數的增大，菌株B-4的降解能力逐漸減弱，而菌株B-3則有一個最適的柴油初始體積分數(1.5%)，此時，其降解能力最強。

(3)與空白樣品對照，柴油初始體積分數較低(<1.0%)時，兩菌株對TPH主要代表性正烷烴組分的降解均較為徹底；隨著柴油初始體積分數的增大，降解程度呈下降趨勢；繼續增大柴油初始體積分數，微生物對柴油的降解受到抑制。

[1] Atlas R M.Bioremediation[J].Chemical and Engineering News，1995，73(14)：32-34.

[2] Gallego J L R，Loredo J，Llamas J F，et al. Bioremediation of diesel-contaminated soils：Evaluation of potentialinsitutechniques by study of bacterial degradation[J].Biodegradation，2001，12(5)：325-335.

[3] Banat I M.Biosurfactants production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation：A review[J].Bioresource Technology，1995，51(1)：1-12.

[4] Boopathy R. Factors limiting bioremediation technologies[J].Bioresource Technology，2000，74(1)：63-67.

[5] Mihopoulos Philip G，Suidan Makram T，Sayles Gregory D, et al. Numerical modeling of oxygen exclusion experiments of anaerobic bioventing[J].Journal of Contaminant Hydrology，2002，58(3-4)：209-220.

[6] 楊金鳳.生物通風修復柴油污染土壤實驗及柴油降解菌的降解性能研究[D].北京：中國地質大學(北京)，2009.

[7] 沈萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社，1999：97-99.

[8] 王紹玲，熊運實，向蘭，等.石油及其它有機污染的生物治理法[J].油氣田環境保護，1994，4(4)：33-38.

[9] 姚偉靜.高效除油微生物菌株的篩選及表面活性劑增強生物降解石油烴的研究[D].重慶：重慶大學，2007.