異辛烷降解菌的篩選及其降解條件的研究

房 斌，蔣林時

(遼寧石油化工大學環境與生物工程學院，遼寧 撫順 113001)

汽油是重要的石油制品，主要由C4～C10烷烴組成，其中異辛烷是其主要成分[1]。汽油在使用過程中會不可避免地發生泄漏和廢棄，造成環境污染，也會通過呼吸、皮膚接觸、飲食攝入等途徑損傷人體[2，3]。環境中汽油的降解是混合菌共同作用的結果，通常不同的降解菌降解不同類型的烴分子[4]。

作者在此從石油污染土壤中篩選、分離純化得到一株能以異辛烷為唯一碳源的菌株，并對其生理生化特性及降解條件進行研究，以期為混合菌株應用于石油污染的微生物修復奠定基礎。

1 實驗

1.1 菌種與培養基

菌種篩選自大慶油田某采油井井臺周圍被石油污染的土壤。

富集培養基(g·L-1)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，pH值7.0。

無機鹽培養基(g·L-1)：NaNO30.5，NaH2PO41.0，無水CaCl20.1，MgSO4·7H2O 0.2，(NH4)2SO40.5，KH2PO41.0，pH值7.0。

固體培養基[5，6]：各培養基中加入2%(質量濃度)瓊脂，pH值7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株的馴化與篩選

取土樣適量，接種于100 mL含500 mg·L-1異辛烷的富集培養基中，于35℃、200 r·min-1搖床培養。按10%(體積分數，下同)的接種量2 d接種1次，使異辛烷濃度逐漸增至1000 mg·L-1、1500 mg·L-1和2000 mg·L-1。然后用以2000 mg·L-1異辛烷為唯一碳源的無機鹽培養基馴化培養4 d。用稀釋平板法將菌液涂布到含500 mg·L-1異辛烷的無機鹽培養基平板上，馴化培養5～7 d，挑取生長良好的單菌落，在富集培養基平板上反復劃線純化3次，接種于無機鹽試管斜面中，待生長良好置于4℃冰箱保存，備用[7]。

觀察記錄菌株生長情況、菌落特征、菌體形態結構、染色反應及生理生化反應，依據《伯杰氏細菌鑒定手冊》對其進行鑒定[8，9]。

1.2.2 異辛烷降解率的測定

將菌株活化液置于含500 mg·L-1異辛烷的無機鹽培養基中，于35℃、200 r·min-1培養72 h，將培養液離心分離(20 min，3000 r·min-1)，取上清液加入0.5%(以樣液體積計)濃硫酸，用20 mL石油醚萃取3次，收集上層清液用無水硫酸鈉脫水，過濾，定容。用紫外分光光度計測定異辛烷殘留量(以吸光度值A217表示)[10，11]，并計算異辛烷的降解率。

1.2.3 菌株生長量的測定

菌株生長量的測定采用光電比濁法[12]。

2 結果與討論

2.1 菌株的篩選分離及鑒定

經過反復馴化、富集培養、劃線分離與純化，篩選到一株具有降解異辛烷能力的菌株，命名為LSH01。

菌落的形態特征：表面粗糙，呈規則線形，扁平，乳白色不透明，挑取時有粘性。鏡檢顯示：菌細胞為長桿狀，菌體呈紫色，屬革蘭氏陽性細菌。生理生化特性：氧化酶陽性，吲哚反應陰性，氧化葡萄糖產酸不產氣，接觸酶陽性，V.P反應陽性，M.R反應陽性，分解含硫氨基酸產硫化氫，產氨實驗陽性，不利用檸檬酸，不水解淀粉，液化明膠，牛奶胨化，還原硝酸鹽。

依據Bergey分類系統(1994)芽孢桿菌屬的基本特征，初步鑒定菌株LSH01為芽孢桿菌屬(Bacillus)。

2.2 菌株LSH01的生長曲線

將菌株LSH01按10%接種量接種于含500 mg·L-1異辛烷的富集培養基中，于35℃、200 r·min-1搖床培養，定時取樣測定OD600，繪制菌株的生長曲線，結果見圖1。

圖1 菌株LSH01的生長曲線

由圖1可知，接種0～10 h，菌株生長量無顯著增加，為延滯期；10～27 h，菌株生長量快速上升，為對數生長期；27～46 h，為穩定生長期；46 h后菌株進入衰亡期。由此可見，菌株LSH01繁殖速度較快、繁殖能力較強、對數生長期較長，對實際應用較有利。

2.3 溫度對菌株LSH01生長和異辛烷降解的影響

菌株LSH01按接種量10%接種，于200 r·min-1、不同溫度下搖床培養72 h，測定異辛烷降解率和菌株生長量，結果見圖2。

圖2 溫度對菌株LSH01生長和異辛烷降解的影響

由圖2可知，溫度為35℃時菌株生長量和異辛烷降解率最高。這可能是因為，微生物產生的酶有最適溫度，溫度較低時，酶活性受到影響，代謝活性差，微生物生長緩慢，導致異辛烷降解效果下降；溫度較高時，蛋白質遭到破壞或凝固，菌株生長受阻，甚至死亡，也導致異辛烷降解效果下降。因此，確定最適溫度為35℃。

2.4 pH值對菌株LSH01生長及異辛烷降解的影響

菌株LSH01按接種量10%接種，于35℃、200 r·min-1搖床培養72 h，考察pH值對異辛烷降解和菌株生長的影響，結果見圖3。

圖3 pH值對菌株LSH01生長和異辛烷降解的影響

由圖3可知，pH值為6.0～8.0時，菌株生長良好，pH值為8.0時生長量最高；pH值為4.0～8.0時，隨著pH值的增大異辛烷降解率逐漸升高，pH值為8.0時降解率達到最大值，此后又逐漸下降。因此，確定最適pH值為8.0。

2.5 異辛烷濃度對菌株LSH01生長及異辛烷降解的影響

菌株LSH01按接種量10%接種，于35℃、200 r·min-1搖床培養72 h，考察異辛烷濃度對異辛烷降解和菌株生長的影響，結果見圖4。

圖4 異辛烷濃度對菌株LSH01生長和異辛烷降解的影響

由圖4可知，異辛烷濃度為500 mg·L-1時，菌株生長量最高；異辛烷降解率隨著異辛烷濃度的增大逐漸下降。因此，確定最適異辛烷濃度為500 mg·L-1。

2.6 接種量對菌株LSH01生長及異辛烷降解的影響

在35℃、200 r·min-1搖床培養72 h條件下，考察接種量對異辛烷降解和菌株LSH01生長的影響，結果見圖5。

圖5 接種量對菌株LSH01生長和異辛烷降解的影響

由圖5可知，異辛烷降解率和菌株生長量隨接種量的增大而升高，但接種量超過15%時，菌株生長量顯著下降。這是因為，隨著接種量的增大，營養物消耗較快，代謝產物積累，菌株生長后期的營養匱乏，生物量減少，從而使菌株生長量下降，降解率趨于平緩。因此，確定最適接種量為15%，此時異辛烷降解率為74.9%。

3 結論

通過富集培養的方法從土壤中分離得到一株能以異辛烷為唯一碳源的菌株LSH01，經形態特征及生理生化特征鑒定，初步確定為芽孢桿菌屬(Bacillus)。其最適生長溫度為35℃、最適pH值為8.0，在接種量為15%時，500 mg·L-1異辛烷降解72 h的降解率為74.9%。

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