卡泊芬凈合成前體Pneumocandin B0的發酵工藝研究

劉 靚，婁 忻，張 莉，關亞鵬

(華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心，河北 石家莊 050015)

卡泊芬凈(Caspofungin,代號MK-0991)是新型抗真菌化合物棘白霉素類中第一個用于臨床的藥物。2001年11月美國FDA和歐洲已批準用于兩性霉素B治療無效或不能耐受兩性霉素B的侵襲性曲霉病患者[1]。卡泊芬凈是葡聚糖合成酶抑制劑，非競爭性地抑制真菌細胞壁的1，3-β-D-葡聚糖的合成，從而發揮殺菌作用[2]，它是天然產物Pneumocandin B0的半合成衍生物。作者以Pneumocandin B0PB5-31為出發菌株，從選育高產菌株和提高產物中有效組分的比例兩方面進行研究，以期提高Pneumocandin B0的發酵水平。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌種

供試菌株為Pneumocandin B0PB5-31。

1.1.2 培養基

(1)分離及斜面培養基：PDA 。

(2)種子培養基：可溶性淀粉、蛋白胨、棉籽餅粉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、玉米漿、碳酸鈣。

(3)發酵培養基：甘露醇、葡萄糖、棉籽餅粉、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶培養

1.2.1.1 搖瓶種子培養

250 mL三角瓶內裝40 mL培養基，接入成熟的斜面孢子，25 ℃、220 r·min-1下搖床培養約48 h。

1.2.1.2 搖瓶發酵培養

250 mL三角瓶內裝40 mL培養基，接入成熟的種子，25 ℃、220 r·min-1下搖床培養約180 h。測定發酵液效價。

1.2.2 菌種誘變與篩選

1.2.2.1 單孢子懸浮液制備

將Pneumocandin B0PB5-31孢子斜面加蒸餾水10 mL，制成孢子懸浮液，倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，充分振蕩，然后用玻璃纖維過濾，制成單孢子懸浮液，供誘變處理使用。

1.2.2.2 氯化鋰敏感度測試

選用氯化鋰濃度為0.40%、0.50%、0.60%進行測試處理。氯化鋰與分離培養基按上述比例混合后，倒制平板，涂布孢子液。培養3～5 d，從菌落生長情況觀察其對氯化鋰的敏感度；10 d左右觀察菌落形態。挑選單菌落進行搖瓶發酵培養，測定效價，比較突變株和對照株。

1.2.2.3 紫外線誘變復合氯化鋰處理[3]

(1)紫外線誘變：取孢子懸浮液5 mL吸入已滅菌的空平皿中，放入紫外照射箱中(紫外照射箱應至少提前30 min開啟)，平皿距離紫外燈28 cm，打開平皿蓋，紫外燈照射4 min，蓋上平皿蓋，取出。稀釋，涂布于空白培養皿中培養。

(2)氯化鋰前處理復合紫外線誘變：制成0.50%氯化鋰單孢子懸浮液，于25 ℃振蕩萌發孢子6 h，取10 mL吸入已滅菌的空平皿中，放入紫外照射箱中(紫外照射箱應至少提前30 min開啟)，平皿距紫外燈28 cm處照射4 min，蓋上平皿蓋，取出。稀釋，涂布于空白培養皿中培養。

(3)紫外線誘變復合氯化鋰后處理：將經紫外誘變處理后的孢子液稀釋，涂布于上層含0.50%氯化鋰的培養皿中培養。

1.2.3 脯氨酸的添加

在發酵培養基中添加脯氨酸，添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，其它成分含量不變。搖瓶發酵，測定有效組分B0與無用雜質A0(后續提取純化中很難分離)的比率，確定適宜的脯氨酸添加量。

1.2.4 樣品檢測

發酵液倒入刻度離心管中，3000 r·min-1離心10 min，取上清液HPLC檢測。沉淀部分所占體積與總取樣體積的比值即為Pmv(%)。

2 結果與討論

2.1 氯化鋰敏感度測試

以Pneumocandin B0PB5-31為出發菌株，用不同劑量的氯化鋰處理，結果見表1。

表1 氯化鋰敏感度測試結果/%

由表1可知，氯化鋰作為單一的因子，本身并無誘變作用。

2.2 紫外線誘變復合氯化鋰處理

以Pneumocandin B0PB5-31為出發菌株，分別采用單一紫外線誘變、氯化鋰前處理復合紫外線誘變、紫外線誘變復合氯化鋰后處理，以未經處理的單孢子懸浮液涂布于空白平板作為對照，結果見表2。

由表2可知，雖然氯化鋰本身并無誘變作用，但與紫外線誘變具有協同作用。氯化鋰前處理復合紫外線誘變和紫外線誘變復合氯化鋰后處理誘變效果均好于單一紫外線誘變，且紫外線誘變復合氯化鋰后處理效果更好，正向變異的幅度更大。

表2 紫外線誘變復合氯化鋰處理的結果

2.3 搖瓶篩選菌株比較

以Pneumocandin B0PB5-31為出發菌株，經單一紫外線誘變處理后篩選出正突變率高的UV-Ⅰ突變株，經氯化鋰前處理復合紫外線誘變、紫外線誘變復合氯化鋰后處理分別篩選出正突變率高的LiCl-UV-Ⅱ突變株、UV-LiCl-Ⅲ突變株，與出發菌株Pneumocandin B0PB5-31進行對比，結果見表3。

表3 搖瓶篩選菌株比較

由表3可知，經紫外線誘變復合氯化鋰后處理篩選出的突變株UV-LiCl-Ⅲ的發酵水平最高，比出發菌株提高了72%。

2.4 脯氨酸添加量的影響(表4)

表4 脯氨酸添加量的影響

由表4可知，脯氨酸可以很好地提高有效組分B0的比例。當脯氨酸添加量為0.3%時，B0∶A0最高，達3.28；繼續增大脯氨酸添加量，B0∶A0反而有所下降。

微生物代謝過程是一系列生化反應的總和，因而在培養液中所分泌的代謝產物不可能是單一的化合物，而是一種混雜體。以抗生素而言，發酵液中包含有多種組分，雖然其分子結構大同小異，但抗菌活性差異極大。生產所需要的產品成分為有效組分，而那些無抗菌活性及抗菌活性差的非產品成分則為雜質。只有提高有效組分的比例，才可能提高成品的收率，從而提高產品質量。提高發酵液中有效組分比例的方法有很多，本研究通過發酵培養基中適量添加脯氨酸提高了有效組分B0的比例。

3 結論

以Pneumocandin B0PB5-31為出發菌， 通過紫外線誘變復合氯化鋰后處理篩選出高產菌株UV-LiCl-Ⅲ，其發酵效價比出發菌株提高了72%。表明紫外線誘變復合氯化鋰后處理是篩選獲得Pneumocandin B0高產菌株的有效手段。發酵培養基中添加0.3%的脯氨酸很好地提高了有效組分B0的比例。

[1] New antimicrobial agents approved by the U.S.Food and Drug Administration in 2001 and new indications for previously approved agents[J].Antimicrob Agents Chemother，2002,46(4):1160.

[2] 高磊.新型抗真菌藥物—卡泊芬凈[J].臨床藥物治療雜志，2005，3(5)：55-58.

[3] 劉頤屏.抗生素菌種選育的理論和技術[J].中國醫藥科技出版社.

[4] 吳雪昌，汪志蕓，周婕，等.提高產抗生素鏈霉菌紫外誘變正變率的研究[J].遺傳，26(4)：499-504.