用紫外分光光度儀測定總蛋白試劑盒的吸收峰和吸光度

何樂春

重慶醫療器械質量檢驗中心（重慶市醫療器械質量與安全控制工程技術研究中心），重慶 401121

總蛋白由白蛋白和球蛋白組成，是血漿固體成分中含量最多、組成復雜、功能廣泛的一類化合物。總蛋白的檢查是主要檢測肝功能代謝能力的試驗，反映肝臟的儲備能力。總蛋白升高往往是由于一種或多種免疫球蛋白增加所引起的，如急性失水、代謝鈉丟失、多發性骨髓瘤等；總蛋白降低大多是由于白蛋白的降低所引起，如水鈉潴留、長期營養不良、嚴重結核、甲亢和惡性腫瘤等。因此，臨床上檢測血清總蛋白及其組分，不僅可作為評價營養狀態及消化功能的指標，而且對肝臟疾病、腎臟疾病、出血性疾病和免疫性疾病等的診斷、治療和預后判斷有重要價值。

1 儀器與材料

1.1 儀器

雙光束紫外可見分光光度儀（北京普析通用儀器有限公司，型號：TU-1901）、電熱恒溫度水浴鍋。

1.2 材料

選用8個廠家生產的總蛋白測定試劑盒，依次編號為1～8號（表1）。TruLab N復合定值質控血清（正常值）為德賽診斷系統（上海）有限公司生產，批號：12335。

2 方法與結果

2.1 實驗原理

雙縮脲法：在堿性條件下，蛋白質分子中的肽鍵與二價銅離子發生雙縮脲反應生成紫紅色的絡合物，其中每個銅離子與5～6個肽鍵絡合，在540～550 nm范圍內有最大吸收峰，且呈色強度在一定濃度范圍內與肽鍵數量即蛋白質含量成正比，經與同樣處理的蛋白質標準液比較，即可求得蛋白質的含量。該法為臨床測定血清總蛋白的首選方法[1-3]。

表1 各總蛋白試劑盒主要成分配方

2.2 試驗方法

2.2.1 選擇8個廠家生產的總蛋白試劑盒，分別按說明書中要求將質控血和相應試劑按一定比例進行加樣，然后將所得混合液在紫外分光光度儀上進行掃描，檢出相應吸收峰和吸光度（表 2）。

2.2.2 第一次試驗掃描時用蒸餾水調零（即用蒸餾水走基線），再用紫外分光光度儀對其混合液進行掃描，連續掃描兩次，得出吸收峰及相應吸收度。

2.2.3 第二次試驗掃描時用各自廠家生產的試劑調零（即用試劑走基線），再用紫外分光光度儀對其混合液進行掃描，連續掃描兩次，得出吸收峰及相應吸收度。

2.2.4 以4號廠家的吸光度為基礎，其他7個廠家分別按質控血清∶試劑的比例計算出相應的理論吸光度和誤差[4-5]。誤差=[（測定值-理論值）/理論值]×100%。

表2 各總蛋白試劑盒的加樣量及試驗條件

2.3 結果

2.3.1 以蒸餾水調零所得的吸收峰和吸光度：用蒸餾水調零后，對其混合液連續掃描2次，分別得出吸收峰及相應吸光度（表3），吸收峰圖譜見圖1。

表3 各總蛋白試劑盒的吸收峰和吸光度（以蒸餾水調零）

圖1 以蒸餾水調零后所得的總蛋白吸收峰圖譜

2.3.2 以試劑調零所得的吸收峰和吸光度∶用試劑調零后，對其混合液連續掃描兩次，分別得出吸收峰及相應吸光度（表4），吸收峰圖譜見圖2。

表4 各總蛋白試劑盒的吸收峰和吸光度（以試劑調零）

圖2 以試劑調零后所得的總蛋白吸收峰圖譜

2.3.3 理論吸光度和誤差的計算：以4號廠家的吸光度為基礎，計算出相應的理論吸光度和誤差（表5）。

表5 各總蛋白試劑盒的理論吸光度和誤差

3 討論

從表3、4檢出的吸收峰波長結果以及相應的圖譜來看，表3所檢出的吸收峰波長已遠遠偏離了說明書中要求的吸收峰波長，表4檢出的吸收峰波長在正常范圍內。即第一次試驗掃描雖然是以蒸餾水調零，對混合液進行平行操作掃描，但連續兩次掃描所得吸收峰波長和理論吸收峰波長之差在10 nm以上，且圖譜比較亂，沒有規律性；而用各自廠家生產的試劑調零后，檢出的吸收峰和理論吸收峰一致，吸收峰之差均在10 nm以內，相應圖譜顯示吸收峰明顯，有一定規律性。

在分析方法學上，8個廠家生產的試劑盒均采用的是終點法。從紫外分光光度儀的特性來講，任一物質通過儀器掃描所得的吸收峰和理論吸收峰之差都應在±2 nm內，這樣所得的結果才能經得起驗證，但考慮到體外診斷試劑的特殊性，所以吸收峰之差在10 nm以內均認同和理論值吸收峰值相一致。

從表4、5的比較中可看出3、5、6號的吸光度與理論吸光度幾乎一致，誤差＜2%，而 1、2、7、8號的吸光度與理論吸光度存在一定差異，誤差范圍在20%以內，排除在試驗操作過程中一些不確定的因素如人為誤差等，各自廠家生產的試劑對其吸光度值起著決定性的作用。8個廠家生產的總蛋白試劑盒均為單試劑，除了1號廠家加了適量防腐劑外，其余廠家的配方完全一樣，在試驗中都用的是終點法且反應原理一樣，之所以出現吸光度值的差異與各自廠家配方的比例不一致有關。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].三部.北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄ⅥB.

[2]朱鐵志.脂血標本總蛋白測定方法的探討[J].中國醫學檢驗雜志,2009,10(2):94-95.

[3]王霞文.臨床生物化學和生物化學檢驗[M].南京:南京大學出版社,1995:180-182.

[4]葉應嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗手冊[M].3版.南京:東南大學出版社,2006:452-456.

[5]中華人民共和國衛生部.WS/T 124-1999臨床化學體外診斷試劑盒質量檢驗總則[S].1999.