p53在肝癌干細(xì)胞中的表達(dá)情況

胡文秀，郝靜云，韓志強

(內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，呼和浩特010050)

干細(xì)胞可以生成多向分化潛能的前體細(xì)胞、定向前體細(xì)胞和已分化的成熟細(xì)胞［1］。肝內(nèi)干細(xì)胞，又稱為肝臟前體細(xì)胞，是核卵圓形、胞質(zhì)很少且嗜酸性的一類小細(xì)胞，其特征不同于肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞。它們具有多向分化潛能，可以分別通過生成中間過渡細(xì)胞——肝細(xì)胞樣細(xì)胞和膽管樣細(xì)胞［2，3］，分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞。與動物模型中誘導(dǎo)出的“卵圓細(xì)胞”及其子細(xì)胞相比，許多研究者發(fā)現(xiàn)人類肝臟前體細(xì)胞也有與之有超微結(jié)構(gòu)相似的三種子細(xì)胞:最原始的前體細(xì)胞，存在于肝板竇狀隙;肝細(xì)胞樣細(xì)胞，存在于肝細(xì)胞之間;膽管上皮樣細(xì)胞，存在于匯管區(qū)。免疫組化檢測單抗OV-6可以有助于識別這些細(xì)胞［1］，OV-6是檢測肝內(nèi)干細(xì)胞的特異性抗體。越來越多的證據(jù)證明肝臟前體細(xì)胞可以生成腫瘤。在動物模型中發(fā)現(xiàn)肝臟前體細(xì)胞的雙向分化潛能與肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生有關(guān)［4］。而且在人類大多數(shù)肝臟疾病中，人們發(fā)現(xiàn)肝臟前體細(xì)胞與肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生有潛在的關(guān)系，并且其數(shù)量與肝臟疾病最終發(fā)生腫瘤的危險性呈正相關(guān)［5］。

由于干細(xì)胞可以自我更新，所以它們也有可能在致癌物的作用下發(fā)生突變。在人類肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中，肝臟前體細(xì)胞發(fā)揮作用的機制還不甚了解。國內(nèi)外學(xué)者通過對在干細(xì)胞內(nèi)的重要抑癌基因——p53的突變檢測而從抑癌基因方面研究干細(xì)胞的致瘤性問題［6，7］。但p53在人類肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)情況尚沒有報道。本實驗的目的在于檢測在人類肝細(xì)胞肝癌中是否存在干細(xì)胞，通過檢測p53在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)情況以探索肝內(nèi)干細(xì)胞與腫瘤的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2000～2008年內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院普外科及外科收治的肝癌患者117例，術(shù)前未經(jīng)放療、化療。所有患者均經(jīng)病理檢查診斷為肝細(xì)胞肝癌。標(biāo)本離體后立即取材，并以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片。

1.2 主要試劑 HepParl和p53抗體購自Zymed公司，OV-6抗體購自R＆D公司。免疫組織化學(xué)SP法檢測試劑盒以及DAB染色試劑盒均購自福建邁新生物工程有限公司。

1.3 實驗方法 石蠟包埋組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，采用常規(guī)SP免疫組織化學(xué)方法檢測HepParl(肝細(xì)胞的標(biāo)志物)、OV-6(干細(xì)胞的標(biāo)志物)以及p53的蛋白表達(dá)情況。

p53為核表達(dá)，采用半定量計分法，選擇具有代表性的3個高倍鏡視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。根據(jù)著色細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞的百分率分為:﹤50%為低表達(dá)，≥50%為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件分析，p53表達(dá)結(jié)果采用百分比進(jìn)行描述，使用Kappa檢驗分析兩組表達(dá)的一致性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HepParl和OV-6的表達(dá)情況 形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)干細(xì)胞散在分布于肝癌組織中或在腫瘤結(jié)節(jié)邊緣成單排或雙排索狀分布，排列成狹窄的小管樣結(jié)構(gòu)與門脈區(qū)膽管相連。肝內(nèi)干細(xì)胞體積較小，細(xì)胞質(zhì)少，細(xì)胞核呈卵圓形，核/質(zhì)比大。在117例肝癌組織中均可見到HepParl和OV-6表達(dá)陽性的肝內(nèi)干細(xì)胞(圖1和圖2)。腫瘤細(xì)胞呈HepParl陽性表達(dá)，但OV-6呈陰性表達(dá)。

圖2 OV-6在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)

2.2 p53的表達(dá)情況 p53呈細(xì)胞核表達(dá)。在117例肝細(xì)胞肝癌組織中，p53在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)者為38例(32%)，而且陽性細(xì)胞主要集中于腫瘤結(jié)節(jié)邊緣。p53在干細(xì)胞高表達(dá)者為36例(31%)，表達(dá)部位接近于腫瘤結(jié)節(jié)的邊緣。p53在腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞的表達(dá)情況具有一致性(Kappa=0.526，P=0.000)。具體表達(dá)情況見圖3和表1。

圖3 p53在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)情況

表1 p53在腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞中的表達(dá)情況

3 討論

人們在許多實體腫瘤組織中，都發(fā)現(xiàn)了干細(xì)胞的存在，雖然在不同的腫瘤干細(xì)胞的來源不同。存在于肝臟赫令管的肝內(nèi)干細(xì)胞［2，8］，又稱為肝臟前體細(xì)胞。在人類正常肝臟中，正常的干細(xì)胞通常處于靜止?fàn)顟B(tài)，處于G0期［1］，而且很難檢測到。只有當(dāng)肝臟嚴(yán)重受損大量的肝細(xì)胞丟失并且其余的肝細(xì)胞在肝毒素或致癌物的作用下增殖受到抑制時，干細(xì)胞才會被激活，大量地存在于肝小葉周圍的匯管區(qū)內(nèi)。越來越多的證據(jù)表明，不論在動物致癌模型中［9］還是人類腫瘤中［10，11］，肝內(nèi)干細(xì)胞與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。與文獻(xiàn)報道基本一致，在肝細(xì)胞肝癌組織中，可以檢測到肝內(nèi)干細(xì)胞。肝內(nèi)干細(xì)胞散在分布于肝癌組織中或在腫瘤結(jié)節(jié)邊緣成單排或雙排索狀分布，排列成狹窄的小管樣結(jié)構(gòu)與門脈區(qū)膽管相連。肝內(nèi)干細(xì)胞體積較小，細(xì)胞質(zhì)少，細(xì)胞核呈卵圓形，核/質(zhì)比大。

在人體中，肝臟再生早期，肝臟前體細(xì)胞表達(dá)OV-6、CK7和chrom-A的免疫活性。在雙向分化期，肝臟前體細(xì)胞向膽管上皮樣細(xì)胞和肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化，并分別呈現(xiàn)出 OV-6、CK7、CK19、chrom-A 以及OV-6、chrom-A的活性增強［2］。由于干細(xì)胞可以自我更新，所以它們也有可能在致癌物的作用下發(fā)生突變。研究發(fā)現(xiàn)，一個發(fā)生突變的干細(xì)胞會生成其他突變的干細(xì)胞并發(fā)生異常增殖，形成癌前病變。多次的突變最終會導(dǎo)致干細(xì)胞群增殖旺盛，凋亡下降，免疫逃避以及生長過度，出現(xiàn)典型的惡性腫瘤的特征［1］。但是或許有人會質(zhì)疑:肝內(nèi)干細(xì)胞只是腫瘤組織中的一小部分細(xì)胞，它們怎么會增殖最后生成腫瘤呢?已經(jīng)有人作過這方面的研究，證明雖然干細(xì)胞只占腫瘤組織的一小部分，但是它們卻有生成腫瘤細(xì)胞的能力，而大多數(shù)腫瘤細(xì)胞卻沒有。近來研究顯示，干細(xì)胞可以是肝癌的重要的治療靶點［2］。

在肝細(xì)胞肝癌中，通常有p53抑癌基因的突變。p53基因突變可以使細(xì)胞異常生長，最終使細(xì)胞基因轉(zhuǎn)變，發(fā)生腫瘤。由于野生型p53蛋白的半衰期很短，用免疫組化所檢測的p53蛋白幾乎都是突變型p53蛋白。在本實驗中，31%(38/123)的肝細(xì)胞肝癌表達(dá)突變型p53蛋白，此百分比接近于腫瘤結(jié)節(jié)周圍的前體細(xì)胞的突變型p53蛋白的表達(dá)陽性率，兩者具有相關(guān)性。在形態(tài)學(xué)表現(xiàn)上，p53高表達(dá)的干細(xì)胞主要集中于腫瘤結(jié)節(jié)邊緣，并且附近的腫瘤細(xì)胞也呈現(xiàn)p53表達(dá)的趨勢，雖然不一定是p53高表達(dá)。由此，是否可以大膽猜測:干細(xì)胞是癌細(xì)胞的起源細(xì)胞，肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生過程可能是正常肝內(nèi)干細(xì)胞長期突變積累的過程。

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