環(huán)孢霉素A聯(lián)合干擾素-α對膀胱癌T24/ADM耐藥逆轉(zhuǎn)的研究

郭 祥，劉紅耀，王靖宇

山西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，山西太原 030001

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，目前膀胱腫瘤的治療手段仍以手術、化療、放療及免疫輔助治療為主。膀胱腫瘤有較高的復發(fā)率（40%～80%），除了膀胱腫瘤本身特有的生物學特性外，膀胱腫瘤多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）的產(chǎn)生，是膀胱癌臨床化療失敗的主要原因之一[1]。MDR成因很多，其中與P糖蛋白（P-gp）、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）和拓撲異構(gòu)酶（TOPO）的異常表達有關[2]。怎樣逆轉(zhuǎn)MDR成為治療腫瘤的難點和熱點。筆者選用以建立耐阿霉素（ADM）的耐藥株，運用不同濃度下的環(huán)孢霉素A（CsA）及干擾素-α（INF-α），單獨及聯(lián)合兩種藥物與ADM共同作用，來探討其逆轉(zhuǎn)效果。現(xiàn)將結(jié)果報道于下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 INF-α （深圳萬樂公司），CsA （上海天豐藥廠），MTT（噻唑藍，美國 SIGMA 公司產(chǎn)品），ADM（天津金耀氨基酸有限公司）。

1.1.2 細胞來源 膀胱癌T24/ADM耐藥株由山西醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科劉紅耀教授惠贈。

1.2 方法

將實驗分成四組實驗組，取對數(shù)生長期的T24/ADM細胞，以5×105/ml接種于96孔板中，在96孔板中每孔加入25 μl的細胞懸液，于37℃、5%CO2、95%的空氣在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每組各孔均以25 μl加入1.0 mg/L濃度的ADM；第一組中加入不同濃度的 CsA：0.1、1.0、2.0、3.0 μg/ml； 第二組中加入不同濃度的 INF-α：2.0×106、4.0×106、10.0×106、20.0×106U/L；第三組加入 1.0 μg/ml的 CsA 與不同濃度的 INF-α（2.0×106、4.0×106、10.0×106、20.0×106U/L）；第四組加入 2.0×106U/L 的INF-α 與不同濃度的 CsA（0.1、1.0、2.0、3.0 μg/ml）。 每組濃度組均設有3個復孔。最后將實驗組和陰性孔（對照組）全部用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基調(diào)整至100 μl。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。實驗終止前6～8 h各孔加入0.5%MTT 50 μl，再培養(yǎng)6 h，顯微鏡下待細胞對照孔有明顯顆粒結(jié)晶時，加入10%SDS-HCl 150 μl終止反應，并于 37℃下存放 12 h。在微孔振蕩器下待顆粒溶解充分后，用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長下測各孔OD值，分別計算細胞抑制率、半數(shù)抑制濃度（IC50）和耐藥倍數(shù)（RI）。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，采用成組設計，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)孢霉素A和干擾素-α分別對膀胱癌T24/ADM耐藥性的影響

本研究結(jié)果表明，INF-α和CsA能不同程度地逆轉(zhuǎn)膀胱癌T24/ADM的耐藥性，且呈明顯劑量效應反應關系。與對照組ADM單獨作用相比，當實驗組CsA濃度為0.1 μg/ml或INF-α濃度為2.0×106U/L時，兩者雖然也能部分提高細胞抑制率，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；當 CsA 濃度≥1.0 μg/ml或INF-α濃度≥4.0×106U/L時，就能明顯提高細胞抑制率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 見表 1、2。

表1 不同濃度的環(huán)孢霉素A對膀胱癌T24/ADM耐藥性的影響（）

表1 不同濃度的環(huán)孢霉素A對膀胱癌T24/ADM耐藥性的影響（）

注：實驗組及對照組ADM均為1.0 mg/L；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別 CsA（μg/ml）00.11.02.03.0對照組第一組第二組第三組第四組生長抑制率（%）12.800±0.02514.700±0.02518.800±0.02525.000±0.02539.500±0.025 t值-P值-4.0206.1179.48021.843＞0.05＜0.05＜0.01＜0.01

表2 不同濃度的干擾素-α對膀胱癌T24/ADM耐藥性的影響（）

表2 不同濃度的干擾素-α對膀胱癌T24/ADM耐藥性的影響（）

注：實驗組及對照組ADM均為1.0 mg/L；“-”表示無數(shù)據(jù)

組別 INF-α（U/L）02.0×106 4.0×106 10.0×106 20.0×106對照組第一組第二組第三組第四組生長抑制率（%）14.100±0.02821.900±0.02637.800±0.02547.400±0.02048.600±0.015 t值-P值-2.71010.00712.98028.883＞0.05＜0.05＜0.01＜0.01

2.2 環(huán)孢霉素A和干擾素-α聯(lián)合對膀胱癌T24/ADM耐藥性的影響

聯(lián)合小濃度的INF-α和CsA與ADM共同作用，與單獨運用INF-α、CsA逆轉(zhuǎn)相比較，小濃度的INF-α和CsA聯(lián)合就能取得滿意的效果（P＜0.05）；當 CsA 濃度為 1.0 μg/ml與 INF-α濃度為4.0×106U/L聯(lián)合作用時，就能超過CsA濃度為3.0 μg/ml單獨作用及INF-α濃度為20.0×106U/L單獨作用時的效果；當CsA 濃度為 0.1 μg/ml聯(lián)合2.0×106U/L的 INF-α 時，就能達到CsA濃度為2.0 μg/ml單獨作用時的效果。見表3、4。

3 討論

T24/ADM細胞是對ADM耐藥的人膀胱癌細胞株。該耐藥細胞株具有MDR的特征。近年來的研究表明干擾素能夠逆轉(zhuǎn)MDR，其機制可能是[3]干擾素通過影響基因的表達，競爭性抑制P-gp和抗癌藥物結(jié)合，使P-gp的藥物泵功能下降，影響了腫瘤細胞的通透性，使細胞內(nèi)的化療藥物濃度增加。還有研究表明[4]，干擾素與一些化療藥聯(lián)合對腫瘤細胞的抑制具有協(xié)同作用，能增加腫瘤細胞內(nèi)化療藥物的濃度，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的MDR，本實驗結(jié)果與其相符。CsA對MDR逆轉(zhuǎn)，其機制可能是[5]通過提高P2糖蛋白（P2gp）磷酸化水平，與P2gp非特異結(jié)合，拮抗P2gp對藥物的結(jié)合和轉(zhuǎn)運，或通過蛋白激酶C改變細胞內(nèi)藥物分布、結(jié)合，以及鈣調(diào)蛋白改變離子通透性、降低細胞內(nèi)谷胱甘肽水平等逆轉(zhuǎn)耐藥[6]。

表3 環(huán)孢霉素A與不同濃度干擾素-α聯(lián)合對膀胱癌T24/ADM耐藥性的影響（）

表3 環(huán)孢霉素A與不同濃度干擾素-α聯(lián)合對膀胱癌T24/ADM耐藥性的影響（）

注：實驗組及對照組ADM均為1.0 mg/L，CsA濃度為1.0 μg/ml

組別 INF-α（U/L）02.0×106 4.0×106 10.0×106 20.0×106對照組第一組第二組第三組第四組生長抑制率（%）19.800±0.02644.700±0.01857.600±0.02572.600±0.01889.600±0.020 t值-P值-21.68020.16818.38619.168＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

表4 干擾素-α與不同濃度環(huán)孢霉素A聯(lián)合對膀胱癌T24/ADM耐藥性的影響（）

表4 干擾素-α與不同濃度環(huán)孢霉素A聯(lián)合對膀胱癌T24/ADM耐藥性的影響（）

注：實驗組及對照組ADM均為1.0 mg/L，INF-α濃度為2.0×106U/L

組別 CsA（μg/ml）00.11.02.03.0對照組第一組第二組第三組第四組生長抑制率（%）21.100±0.02637.800±0.02844.900±0.02351.200±0.02758.200±0.024 t值-P值-15.62038.12039.86023.832＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著CsA濃度的增加，ADM對膀胱癌腫瘤細胞毒性逐漸加強，對膀胱癌腫瘤細胞MDR的逆轉(zhuǎn)作用與CsA的濃度呈明顯劑量效應關系；聯(lián)合INF-α與CsA逆轉(zhuǎn)T24細胞MDR，結(jié)果表明當INF-α濃度為2.0×106U/L，CsA濃度為0.1 mg/ml時就與CsA濃度為3.0 mg/ml單獨逆轉(zhuǎn)的效果相當，而且隨著CsA濃度的增加，協(xié)同作用明顯增強（P＜0.01）。本實驗表明雖然單獨運用INF-α、CsA也能逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞MDR，但聯(lián)合應用則作用明顯，能減少這些藥物單獨運用時的劑量，加強了化療藥物的抗腫瘤作用，起到了“1+1＞2”的效果，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

[1]Shen F,Chu S,Bence AK,et al.Quantitation of doxorubicin uptake,efflux,and modulation of multidrug resistance(MDR)in MDR human cancer cells[J].The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,2008,324(1):95-101.

[2]Uno K,Suginoshita Y,Kakimi K,et al.Impairment of IFN-αproduction capacity in patientswith hepatitis C virus and the risk of the development of hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2005,11(46):7330-7334.

[3]Marotta G,Frassoldati A,Zinzani P,et al.Role of interferon alpha administration after 2-deoxycoformycin in the treatment of hairycell leukemia patients[J].Eur J Haematol,2006,77(2):109-113.

[4]Shapira Y,Arthur M,Calvin C,et al.Therapeutic time window and dose response of beneficial of ketamine inexperimental head injury[J].Stroke,1994,25(8):1637-1643.

[5]徐玉喬,惠延平,馬世榮.環(huán)孢霉素A逆轉(zhuǎn)人白血病耐藥細胞系HL260/ADM及其超微弱發(fā)光的觀察[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2007,7(5):663-666.

[6]熊茂明,區(qū)慶嘉,孟翔凌,等.環(huán)孢霉素A逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥的實驗研究[J].中華實驗外科雜志,2004,21(5):544-546.