黃蘑多糖對H22荷瘤小鼠腫瘤生長及其VEGF表達的影響

朱惠彬 ，朱順星 ，程 純

1.南通大學醫學院研究生院，江蘇南通 226001；2.南通大學醫學院實驗動物中心，江蘇南通 226001；3.南通大學，江蘇南通 226019

目前化學治療是腫瘤治療中不可缺少的方法之一，然而化學治療常引起患者免疫系統抑制、感染、胃腸道反應等多種并發癥，甚至加速患者的死亡[1]。環磷酰胺雖然是臨床常用的化療藥物，但能抑制免疫系統，干擾淋巴細胞的增殖。所以，抗腫瘤藥物的研究不僅要強調能有效殺滅瘤細胞，更要注意積極調動患者自身的免疫功能。黃蘑（huangmo），學名亞側耳（hohenbuehelia serotina），俗稱凍蘑、元蘑，為側耳科側耳屬的低溫型野生大型食用菌，其多糖是目前抗腫瘤研究的熱點。已有研究顯示，黃蘑多糖提取物具有提高免疫力的作用[2]，并能抑制H22、S180、艾氏腹水瘤[3]。本實驗通過建立小鼠體內移植性肝癌模型，對黃蘑多糖提取物抑制H22荷瘤小鼠的腫瘤生長進行實驗研究，并對其抗肝癌的作用機制進行初步探討，現將結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 瘤細胞株與實驗動物

肝癌H22細胞株由中國典型培養物保藏中心提供。6～8周齡 BALB/c 小鼠 48 只，雌雄各半，體重（20±2）g，由南通大學醫學院實驗動物中心提供，實驗室常規飼養3 d。

1.2 試劑與儀器

黃蘑多糖提取物（β-D-半乳-葡聚糖苷，分子量35000，由南通大學醫學院免疫學實驗室提供），環磷酰胺粉劑（江蘇恒瑞制藥有限公司，國藥準字 H32020857，批號：09012421），VEGF兔抗小鼠多克隆抗體（北京中山生物技術有限公司，臨用前用PBS按1∶50稀釋。二步法免疫組化檢測試劑盒：GBICO公司），DAB工作液（北京中山生物技術有限公司），低溫冷凍切片機（Leica公司），正、倒置顯微鏡（Olympus公司），圖象分析系統（Leica公司），恒溫水浴鍋（Pharmacia公司），電熱恒溫干燥箱（江蘇海門恒昌儀器廠），YJ-875醫用凈化工作臺（蘇州凈化設備廠），超低溫冰箱（德國JOUAN公司）。

1.3 模型建立與處理

培養H22細胞至對數生長期，每只小鼠左腋皮下以5×106個/ml的瘤細胞懸液接種0.2 ml，連續觀察一周，造模成功后將小鼠隨機分為6組，每組8只，其中，正常組和模型組給予生理鹽水0.2 ml/d，環磷酰胺組（CTX組）給予環磷酰胺0.01 g/（kg·d），黃蘑多糖低、中、高劑量組分別給予黃蘑多糖0.02、0.10、0.50 g/（kg·d），給藥體積均為每只 0.2 ml/d，給藥途徑均為灌胃給藥，連續給藥12 d。

1.4 抑瘤率、免疫指標及VEGF組織學檢測

停藥次日將小鼠頸椎脫臼處死，稱取體重；眼球取血，以EDTA抗凝，倒置顯微鏡下計數有核細胞數目；剝離脾臟、胸腺、瘤塊分別稱重，計算脾指數、胸腺指數和抑瘤率。脾指數=脾重×103/體重，胸腺指數=胸腺重×103/體重，按平均瘤重計算抑瘤率，抑瘤率 （%）=[（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）／模型組平均瘤重]×100%。取瘤組織做冰凍切片免疫組化檢驗VEGF的表達情況。

1.5 染色評分與VEGF表達的判定

VEGF陽性染色的標準：細胞漿中出現棕色顆粒。先在低倍鏡下觀察陽性細胞的分布情況，每例切片隨機選取5個視野，再以200×高倍鏡計數，每個視野取100個細胞的陽性細胞數。參考Fromowitz綜合計分法[4]進行染色評定：總分=陽性細胞比例分值+染色強度分值。陽性細胞比例評定標準：陽性細胞數＜5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；＞75%為4分。染色強度評定標準：陰性染色為0分；染色雖弱但明顯強于陰性對照為1分；染色強度中等為2分；強染色為3分。將兩種評分相加，結果分為 4 個等級：0～1 分為（-）；2 分為（+）；3～4 分為（++）；5～7分為（+++）。按綜合評分的等級來評價各組切片的指標變化情況，染色評分值越高，則對應的VEGF表達水平越高。

1.6 統計學方法

實驗數據采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計分析，計量資料數據以均數±標準差（）表示，行方差分析和LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃蘑多糖的抑瘤作用及對免疫器官的影響

黃蘑多糖各組的腫瘤重量均低于模型組，其中，中、高劑量組的抑瘤效果顯著（P＜0.05）。CTX組雖然腫瘤重量明顯低于黃蘑多糖各組（P＜0.01），但也顯示了極強的毒副作用，小鼠一般狀態極差，神情呆滯，行帶遲緩，給藥期間死亡2只。相反，黃蘑多糖各組相對CTX組，小鼠精神狀態較好，活動較靈活，脾指數、胸腺指數、有核細胞數均顯著高于CTX組（P＜0.01），同時也高于模型組（P＜0.05），顯示了較好的免疫增強作用。見表1、2。

表1 黃蘑多糖對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用（）

表1 黃蘑多糖對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用（）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 CTX 組比較，#P＜0.05

正常組（n=8）模型組（n=8）CTX 組（n=8）黃蘑多糖低劑量組（n=8）黃蘑多糖中劑量組（n=8）黃蘑多糖高劑量組（n=8）組別 取材時體重（g）22.6±0.824.8±2.622.0±2.622.4±2.322.0±1.922.7±1.6瘤重（g）02.1±1.50.5±0.2**1.4±1.1#0.9±0.3*0.7±0.8*抑瘤率（%）00.076.233.357.166.7

表2 黃蘑多糖對H22荷瘤小鼠免疫系統的影響（）

表2 黃蘑多糖對H22荷瘤小鼠免疫系統的影響（）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 CTX 組比較，##P＜0.01

正常組（n=8）模型組（n=8）CTX 組（n=8）黃蘑多糖低劑量組（n=8）黃蘑多糖中劑量組（n=8）黃蘑多糖高劑量組（n=8）組別 脾指數（mg/g）48.9±19.249.4±13.617.0±6.2**55.2±13.8*##55.7±9.1*##56.1±11.0*##胸腺指數（mg/g）22.4±5.620.4±7.37.5±6.7**21.5±6.5##24.4±3.5*##27.1±6.9*##有核細胞數（109/L）2.7±1.02.6±1.41.2±0.2**3.5±1.5*##3.7±1.2*##4.3±0.9*##

2.2 黃蘑多糖對瘤組織VEGF表達的影響

黃蘑多糖各組的VEGF表達率顯著低于模型組（P＜0.01），黃蘑多糖低、中劑量組VEGF的表達與CTX組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），高劑量組與CTX組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），顯示了較強的抗腫瘤血管生成能力。見表3。

表3 黃蘑多糖對小鼠瘤組織VEGF表達的影響（，分）

表3 黃蘑多糖對小鼠瘤組織VEGF表達的影響（，分）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與 CTX 組比較，#P＜0.05

模型組（n=8）CTX 組（n=8）黃蘑多糖低劑量組（n=8）黃蘑多糖中劑量組（n=8）黃蘑多糖高劑量組（n=8）組別 給藥量（g/kg）-0.010.020.100.50樣本例數 陽性例數8888888888染色評分13.2±1.52.9±2.8**5.9±3.4**#4.1±2.8**#3.5±1.7**

3 討論

目前醫學界關于腫瘤的形成發展有種較成熟的觀點：腫瘤的惡性增殖、轉移必須依賴持續和廣泛的血管生成。而VEGF是腫瘤中主要的血管生長因子，誘導腫瘤內形成管壁不完整的新生血管，一方面為腫瘤生長提供血液供應；另一方面，不完整的新生血管增加了腫瘤細胞遠處轉移的機會，在腫瘤發展中不僅與腫瘤生長和病理分級有關，還影響腫瘤的預后[5]。肝細胞癌作為多血管性腫瘤，其生長及轉移均與血管新生有關，已證實其VEGF呈高表達，且VEGF不僅通過調節血管新生促進腫瘤生長，還可能直接作用于腫瘤細胞[6]。有文獻報道[7]，中草藥的提取成分可以降低瘤組織內VEGF的表達。

本實驗結果顯示，黃蘑多糖對H22移植性肝細胞癌的生長具有一定的抑制作用，且其抗瘤作用與給藥劑量呈一定的量效關系，同時黃蘑多糖組的免疫器官重量較CTX組和模型組顯著提高，有核細胞數也明顯高于CTX組和模型組（P＜0.01 或 P＜0.05），而馬巖等[8]的研究顯示，黃蘑多糖的提取物對輔助環磷酰胺治療腫瘤具有一定的減毒增效作用，其抗瘤效果優于單獨使用CTX或黃蘑多糖。此外，本實驗通過檢測瘤組織VEGF的表達情況，證實黃蘑多糖各組VEGF的表達顯著低于模型組，并呈一定的濃度依賴性（P＜0.05）。因此，筆者推測黃蘑多糖的抑瘤效應存在多個作用靶點：①作為生物反應調節劑調節機體自身免疫。②抑制腫瘤組織中VEGF的生成，進而抑制血管內皮細胞的增殖、遷移，影響腫瘤血管的生成，減少瘤組織血供。③可能存在其他如促進細胞凋亡、抑制細胞的增殖、干擾細胞信號傳導等途徑。鑒于黃蘑多糖在輔助抗腫瘤治療上具有一定的藥用價值，值得進一步研究。

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[2]Ma Y,Ma Y Z,Zhang J Y,et al.Regulatory effects of polysaccharide Fb from Huangmo on immunological fuctuin in mice[J].J Jilin Univ:Med Ed,2005,31(5):692-695.

[3]Cao R,MA Y,Mizuno T.Chemical constituents of a heatdried Chinese mushroom:Hohenbuehelia serotina[J].Biosci Biotech Biochem,1996,60(4):654-655.

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[5]陳莉,程純.現代病理學臨床研究的基本問題[M].北京:科學出版社,2007:88-96,282.

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[8]馬巖,張銳,于小風,等.黃蘑多糖對荷瘤小鼠化療的減毒增效作用[J].中草藥,2006,37(8):1199-1202.