磺胺醋酰鈉滴眼液無菌檢查方法驗證

劉全芳，鄭紹忠，張 婷

解放軍第一七五醫院（廈門大學附屬東南醫院）藥劑科，福建漳州 363000

磺胺醋酰鈉滴眼液為廣譜抑菌劑，能抑制大多數革蘭陽性菌、沙眼衣原體以及部分革蘭陰性菌。《中國藥典》2005年版[1]規定對滴眼液只需進行微生物限度檢查即可，新頒布的《中國藥典》2010年版[2]對此規定作出了修改，變更為眼用制劑需進行無菌檢查。《中國藥典》2010年版規定建立無菌檢查法時，應對該方法進行驗證，以證明該方法可用于該產品的無菌檢查。筆者用薄膜過濾法對3批磺胺醋酰鈉滴眼液進行無菌檢查，并對此方法進行了驗證，確定了磺胺醋酰鈉滴眼液無菌檢查的檢驗條件和方法[3]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Htysteritest601集菌儀（杭州泰林生物技術設備有限公司）、HTY反復使用全封閉薄膜過濾器（杭州泰林生物技術設備有限公司），孔徑為0.45 μm、直徑為5 cm的微孔濾膜（上海市新亞凈化器件廠），DG-2B多功能恒溫箱（上海醫療器械廠）；HWS-400型恒溫恒濕箱（上海精宏實驗設備有限公司）；LDZX-40SCI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；101-2A型數顯式電熱恒溫干燥箱（上海陽光實驗儀器有限公司）。

1.2 試驗菌株

大腸埃希菌（escherichia coli）[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、生孢梭菌（clostrididium sporogenes）[CMCC （B）64941]、 枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、白色念珠菌（candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（aspergillus niger）[CMCC（F）98003]（以上菌種均購于廈門市藥品檢驗所，其中大腸埃希菌為第4代，其余菌均為第3代）。

1.3 培養基

營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、營養肉湯培養基、改良馬丁瓊脂培養基、硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基，以上均購于廣東環凱微生物科技有限公司。

1.4 試藥

磺胺醋酰鈉滴眼液（解放軍第一七五醫院藥劑科制劑室，規格：0.5%×8 ml，批號：100316、100401、100513），無菌氯化鈉注射液（解放軍第一七五醫院藥劑科制劑室，規格：0.9%×100 ml，批號：1000614）。

2 方法與結果

驗證操作環境為10000級潔凈條件下的局部100級單向流空氣區域內進行。

2.1 菌液的制備

取經35℃培養21 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的營養肉湯培養物1 ml，用0.9%的無菌氯化鈉注射液稀釋至含菌數約為50～100 cfu/ml的菌懸液，做活菌計數備用；取經35℃培養21 h的生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養物1 ml，用0.9%的無菌氯化鈉注射液稀釋至含菌數約為50～100cfu/ml的菌懸液，做活菌計數備用；取經25℃培養48 h的白色念珠菌改良馬丁培養物1 ml，用0.9%的無菌氯化鈉注射液稀釋至含菌數為50～100 cfu/ml的菌懸液，做活菌計數備用；取經25℃培養5～7 d的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養物，用5 ml 0.9%的無菌氯化鈉注射液洗脫下霉菌孢子，并將孢子懸液過濾至無菌試管內，吸取1 ml孢子懸液，用0.9%的無菌氯化鈉注射液稀釋至含孢子數為50～100 cfu/ml的孢子懸液，做活菌計數備用。每批試劑平行做2次。菌液制備結果，見表1。

表1 菌液的稀釋度及菌落數（cfu/ml）

表2 各試驗菌的驗證結果

2.2 方法的驗證（薄膜過濾法）[4]

菌液組：將上述制備好的菌液各1 ml分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養基（50 ml/支）和改良馬丁培養基（50 ml/支）中。試驗組：取相同批號供試品3瓶，按照《中國藥典》2010年版無菌檢查薄膜過濾法進行過濾，即吸取藥液20 ml注入100 ml無菌氯化鈉注射液中，過濾，并用5袋無菌氯化鈉注射液（100 ml/袋）沖洗，在最后1袋沖洗液中加入相應的試驗菌液1 ml，沖洗完后，取出濾膜，接種至硫乙醇酸鹽流體培養基或改良馬丁培養基中。供試品對照組：方法同試驗組，但不加試驗菌。空白對照組：取同批配制的硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基各1支作空白對照。

按規定條件將上述培養基培養3～5 d，逐日觀察。各試驗菌的驗證結果，見表2。

由以上試驗結果可知，采用薄膜過濾法，用無菌氯化鈉注射液作為溶劑和沖洗劑，即吸取20 ml供試品注入100 ml無菌氯化鈉注射液中，過濾，用5袋無菌氯化鈉注射液（100 ml/袋）沖洗，各試驗菌均在規定時間3～5 d內生長良好，并與菌液組中相應的菌落生長情況相似，且供試品對照組和空白對照組均無菌落生長，故可采用薄膜過濾法用無菌氯化鈉注射液作為溶劑和沖洗劑對磺胺醋酰鈉滴眼液進行無菌檢查。

3 討論

磺胺醋酰鈉滴眼液為短效磺胺類藥物，含有磺胺醋酰鈉成分，為廣譜抑菌劑，抗菌作用雖弱，但能抑制大多數革蘭陽性菌、沙眼衣原體以及部分革蘭陰性菌。為消除該藥的抑菌作用對試驗結果產生的影響，筆者在選擇無菌檢查方法時選用薄膜過濾法，用500 ml無菌氯化鈉注射液（100 ml/次）分5次沖洗，可消除其抑菌活性，并不損傷濾膜，結果可靠且操作簡便，故可以用此法對其進行檢驗。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京:化學工業出版社,2005:附錄ⅪH.

[2]國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄ⅪH.

[3]肖莉.酚磺乙胺注射液無菌檢查的方法驗證[J].中國藥業,2008,17(4):38.

[4]戴暈,劉鵬,馬仕洪,等.快速建立注射用頭孢菌素無菌檢查法的探討[J].藥物分析雜志,2007,27(2):208.