丹紅注射液中細菌內毒素的檢測

張秀花

山東省菏澤市藥品檢驗所，山東菏澤 274000

丹紅注射液是由丹參和紅花兩種中藥材經化學提取精制而成的注射液，具有活血化瘀，通脈舒絡之功效，用于瘀血閉阻所致的胸痹、中風、胸痛、胸悶、心悸、口眼歪斜、言語蹇澀、肢體麻木、活動不利等癥，并用于冠心病、心絞痛、心肌梗塞、瘀血型肺心病、缺血性腦病、腦血栓等。由于療效顯著，臨床應用日趨廣泛[1]，為國家重點保護的中藥品種。作為重點檢驗項目之一的安全性評價，目前仍采用家兔法檢查熱原[2]。細菌內毒素檢查具有快速、靈敏、操作簡便、重現性好的特點。為此，特采用此法取代家兔熱原檢查法檢測丹紅注射液中細菌內毒素，旨在為丹紅注射液的應用提供更為科學的檢測方法。

1 儀器與試藥

鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司，批號：1007020，靈敏度0.125 EU/ml；福州新北生化工業有限公司，批號：10111912，靈敏度0.125 EU/ml），細菌內毒素檢查用水（湛江博康海洋生物有限公司，批號：1005050，內毒素含量≤0.015 EU/ml），細菌內毒素工作標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：150601-201072，每支 120 EU），丹紅注射液（菏澤步長制藥有限公司，批號：110164、110174、110172），旋渦混合器（常州國華電器有限公司），TAL-40D型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）。

2 方法與結果

2.1 丹紅注射液中細菌內毒素限值（L）確定

根據公式L=K/M，其中，K為每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑K=5.0 EU/（kg·h），M為人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量。丹紅注射液臨床最大用量成人為60 ml[2]，按成人體重60 kg計算，代入公式計算丹紅注射液的細菌內毒素限值，L=K/M=5.0／（60/60）=5.0 EU/ml。

2.2 供試品的最大有效稀釋倍數（MVD）

市售鱟試劑的靈敏度（λ）在0.5～0.03 EU/ml之間，根據《中國藥典》2010年版二部附錄 “細菌內毒素指導原則”，丹紅注射液的有效稀釋倍數為10～167倍，本試驗采用靈敏度為 0.125 EU/ml的鱟試劑，MVD=L/λ=1×（5.0/0.125）=40倍。

2.3 鱟試劑靈敏度的復核

按細菌內毒素檢查法[3]，將細菌內毒素工作標準品（WSE）用細菌內毒素檢查用水（BET水）溶解，在旋渦混合器上混合15 min，然后制成 2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ 系列濃度的內毒素工作標準品溶液，每稀釋一步，均在旋渦混合器上混合30 s，每一濃度平行做4管，同時做2管陰性對照。將試管振搖混合均勻后，置于（37±1）℃試管恒溫儀中 60 min，結果兩批鱟試劑的靈敏度均在0.5 λ～2.0 λ范圍內，可用于供試品的干擾試驗。見表1。

表1 鱟試劑靈敏度的復核試驗結果

2.4 供試品的干擾初篩試驗[4]

用BET水將丹紅注射液分別稀釋成 40、20、10、5倍的系列濃度，以各稀釋倍數的樣品將 WSE 制成 2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ系列濃度的供試品內毒素溶液，與鱟試劑混合進行抑制試驗。結果顯示，供試品原液對鱟試劑有抑制作用，當稀釋至5倍時無干擾作用，3份樣品結果均相同。見表2。

表2 供試品的干擾初篩結果

2.5 供試品的干擾試驗

根據干擾初篩試驗結果[5]，最小不干擾濃度為5倍樣品稀釋液。為確保檢測結果準確可靠，本試驗采用10倍樣品稀釋液進行正式干擾試驗。用丹紅注射液（BET水10倍稀釋液）將 WSE 稀釋制成 2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ 系列濃度的供試品內毒素溶液，每一濃度平行做4管，另取BET水和10倍樣品稀釋液各做兩管陰性對照液，依法操作[6]。結果表明，Es均在 0.5 λ～2.0 λ 范圍內，且 Et也均在 0.5 Es～2.0 Es 范圍內。說明樣品稀釋10倍后，對鱟試劑無干擾作用。見表3。

表3 供試品干擾試驗結果

2.6 供試品溶液的細菌內毒素檢測[7]

根據干擾試驗的結果和擬定的細菌內毒素濃度，取樣品3批，分別用BET水稀釋10倍后，采用兩個廠家的鱟試劑進行檢測，結果均符合規定。見表4。

表4 樣品稀釋溶液的細菌內毒素檢測結果

3 討論

參考有關文獻[8-9]，采用兩個廠家的鱟試劑對3個批次的樣品進行干擾試驗，從初篩試驗可以看出，丹紅注射液對鱟試劑有干擾作用，當樣品稀釋至5倍時，可以排除干擾，確定最小不干擾濃度為5倍樣品稀釋液。為確保試驗結果的準確可靠，提高檢測靈敏度，建議實際操作時將樣品稀釋10倍或采用更高靈敏度的鱟試劑。此試驗說明，細菌內毒素檢查法可以代替家兔法用于熱原檢查。

[1]胡燕,趙亞清,肖峰,等.丹紅注射液治療急性腦梗死隨機對照試驗的Meta分析[J].中國醫院藥學雜志,2009,29(20):1795.

[2]國家藥品監督管理局.國家中成藥標準匯編[S].內科心系分冊,2002:278.

[3]國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄99.

[4]鄭霞,趙毓梅,劉春.葛根素注射液細菌內毒素檢查[J].中國藥房,18(16):1254.

[5]夏振民.藥品細菌內毒素檢查的限值[J].藥物分析雜志,1995,15(3):54-55.

[6]陳燕華,徐晉輝.脈絡寧注射液中細菌內毒素的檢查[J].華西藥學雜志,2005,20(1):69-70.

[7]張偉,周繼春.硫酸羅通定注射液細菌內毒素檢查法的研究[J].2009,10(6):429-432.

[8]中國生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:310-320.

[9]梁陳方,李錦燊.凝膠法測定新魚腥草素鈉注射液細菌內毒素[J].廣西醫學,2006,28(11):1775-1776.