Rab7 GTPase負向調(diào)節(jié)巨噬細胞中poly I:C誘導的細胞因子的表達①

王玉珍 謝基明 王寧飛 劉 帥 (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,呼和浩特010018)

Rab GTPases(Ras-related proteins in brain)是Ras超家族中的一類GTP酶。一些Rab蛋白在從酵母到人類的進化過程中高度保守[1]。Rab蛋白調(diào)控著囊泡的出芽、形成、轉(zhuǎn)運、錨定和融合等過程[2]。Rab GTPases能夠在GTP結(jié)合的活性形式和GDP結(jié)合的非活性形式之間轉(zhuǎn)換。在GTP結(jié)合的活性形式,GTPases與下游的效應分子相互作用,共同調(diào)節(jié)了囊泡轉(zhuǎn)運的各個環(huán)節(jié)[3]。

Rab GTPase 7(Rab7)定位于晚期內(nèi)體/溶酶體結(jié)構(gòu),調(diào)控著囊泡運輸?shù)耐砥谶^程[4]。近年來的研究表明,Rab7通過轉(zhuǎn)運受體蛋白廣泛地參與了信號轉(zhuǎn)導過程。Rab7參與轉(zhuǎn)運血管緊張素II受體 1A(AT1AR)、EGFR、神經(jīng)生長因子受體TrKA到溶酶體降解[5-7]。Rab7與Toll-like receptors(TLRs)的關(guān)系如何,報道甚少。

多聚肌苷酸poly I:C(polyinosinic-polycytidylic acid)是一種人工合成的模擬病毒RNA的雙鏈RNA(dsRNA),誘導免疫細胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素,類似于病毒感染后效應[8]。poly I:C誘導的活化效應是通過Toll-like receptor 3(TLR3)來介導的[9]。TLRs是一類模式識別受體,通過識別病原體相關(guān)的分子模式,啟動免疫應答。盡管TLRs信號的充分活化對于清除入侵的病原體必不可少,但是TLRs的過度活化可能促進免疫病理性疾病的發(fā)生[10],因此負向調(diào)節(jié)TLRs的信號轉(zhuǎn)導過程成為當前研究的熱點問題。

在TLRs的信號轉(zhuǎn)導過程中,TLR3活化免疫細胞是通過胞內(nèi)的接頭蛋白TRIF促進前炎癥因子以及IFN-α/β的產(chǎn)生[11]。負向調(diào)節(jié)TLR3的信號轉(zhuǎn)導通路,從而抑制前炎癥因子以及IFN-α/β的產(chǎn)生對于防治自身免疫性疾病具有積極的意義。

在本實驗中,通過構(gòu)建Rab7的失活突變載體,研究Rab7失活突變后對poly I:C激活的巨噬細胞RAW264.7中前炎癥因子以及IFN-β的影響。該實驗為進一步研究Rab7對TLR3信號通路的調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑 小鼠巨噬細胞系RAW264.7來自于ATCC;胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco公司;poly I:C購自Sigma公司;TRIZOL、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶,real-time PCR mix均為寶生物公司產(chǎn)品;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司;Rab7抗體、actin抗體均為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 突變載體的構(gòu)建 將測序正確的野生型Rab7真核表達載體pcDNA3.1-Rab7經(jīng)過PCR定點突變將Rab7蛋白序列中GKT/S結(jié)構(gòu)域22位的T(蘇氨酸)突變?yōu)镹(天冬氨酸)。該突變載體記為pcDNA3.1-tRab7。這種突變使Rab7與GTP的結(jié)合能力下降,表現(xiàn)為功能顯性失活[12]。突變導入引物為:sence5′-GGT GTT GGA AAG AAC TCT CTC-3′和 antisence 5′-GTT GGGGGCAGT CACATC-3′。PCR 反應條件為:94℃變性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸5分鐘,30個循環(huán),后續(xù)的PCR產(chǎn)物酶切、連接反應和細菌轉(zhuǎn)化實驗按試劑盒說明書進行。陽性克隆經(jīng)測序鑒定。

1.3 小鼠巨噬細胞株RAW264.7的培養(yǎng)及細胞轉(zhuǎn)染 RAW264.7細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),1～2天換液或傳代一次。細胞轉(zhuǎn)染時,將適量的RAW264.7巨噬細胞接種于相應的細胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中(24孔板:2×105;6孔板:4×105),37℃培養(yǎng)過夜。待細胞密度達到近90%時,進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法參照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000的說明書進行。轉(zhuǎn)染后40小時,采用poly I:C(10μg/ml)進行刺激。

1.4 總RNA提取及定量分析 總RNA采用TRIZOL試劑根據(jù)說明進行提取。RT-PCR和 real-time PCR 使用的 引 物 序列 為:IFN-β:5′-CGTTCCTGCTGTGCTTCT-3′(sence)和 5′-GTCCGCCCTGTAGGTGAG-3′(antisence)。IP10:5′-TGCCGTCATTTTCTGCCT-3′(sense)和 5′-GGTCATCATTCTTTTTCATCGT-3′(antisence)。TNF-α:5′-ACT TGG TGG TTT GCT ACG-3′(sence)和5′-ACT GAA CTT CGG GGT GAT-3′(antisence)。 IL-1β:5′-TTG GGG TCC GTC AAC TTC-3′(sence)和 5′-CTA ATA GGCTCA TCTGGG-3′(antisence)。real-time PCR采用ABI 7300(Applied Biosystems,USA)and SYBR RT-PCR kit進行檢測分析,計算方法采用2-ΔΔct法 。

1.5 Western blot檢測 2×105RAW264.7在密度達到90%時轉(zhuǎn)染1μg的 pcDNA3.1、pcDNA3.1/mRab7和pcDNA3.1/tRab7。轉(zhuǎn)染后48小時,提取胞漿蛋白,BCA法測定蛋白濃度,等量的蛋白進行SDSPAGE。蛋白隨后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜,采用Rab7的一抗和相應二抗與膜孵育,ECL法檢測結(jié)果。同時檢測actin的表達作為上樣一致的內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗分析,P＜0.05時認為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 Rab7突變載體的構(gòu)建及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞后Rab7表達 我們將測序正確的Rab7真核表達載體采用定點突變法進行Rab7突變質(zhì)粒的構(gòu)建。在圖1A的Rab7的蛋白序列中,GDSGVGKT是GTP酶家族保守的、與GTP結(jié)合的區(qū)域,其中該結(jié)構(gòu)域中的T(蘇氨酸)突變?yōu)镹(天冬氨酸)后,表現(xiàn)為與GTP結(jié)合能力下降的顯性失活形式。然后我們將突變質(zhì)粒 pcDNA3.1-tRab7及其對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞,轉(zhuǎn)染后48小時,檢測Rab7的表達。如圖1B所示,與對照組相比,野生型和突變Rab7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Rab7的蛋白水平都顯著增高,顯示出過表達狀態(tài)。

2.2 Rab7抑制了poly I:C誘導的IFN-β表達 我們檢測了 Rab7過表達后對 poly I:C刺激的RAW264.7巨噬細胞IFN-β的產(chǎn)生。如圖2A、B所示,Rab7過表達后顯著抑制了 IFN-β的表達,Rab7突變后卻促進了IFN-β的表達,說明Rab7 GTPase是以GTP結(jié)合的活性方式來發(fā)揮作用的。

2.3 Rab7抑制了poly I:C誘導的IP10的表達 我們檢測了Rab7過表達后對poly I:C刺激的RAW264.7細胞趨化因子IP10的表達。Rab7也是以依賴GTP結(jié)合活性的方式抑制了IP10的表達(圖3A、B)。

圖1 Rab7突變示意圖及Rab7的表達水平Fig.1 The diagram of Rab7 mutation and detection of Rab7 expression

圖2 Rab7抑制了RAW264.7細胞中poly I:C誘導的IFN-β表達Fig.2 Rab7 inhibited the expression of IFN-βin RAW264.7 after stimulation with poly I:C

圖3 Rab7抑制了RAW264.7細胞中poly I:C誘導的IP-10表達Fig.3 Rab7 inhibited the expression of IP10 in RAW264.7 after stimulation with poly I:C

圖4 Rab7抑制了RAW264.7細胞中poly I:C誘導的TNF-α和 IL-1βFig.4 Rab7 inhibited the expression of TNF-α和 IL-1β in RAW264.7 after stimulation with poly I:C

2.4 Rab7抑制了前炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達 前面的研究結(jié)果顯示,Rab7能夠通過結(jié)合GTP的活性形式抑制poly I:C誘導的IFN-β和IP10的表達。這兩個細胞因子是受轉(zhuǎn)錄因子IRF3或IRF7調(diào)控,我們想進一步探索,Rab7是否對poly I:C活化TLR3的信號通路中轉(zhuǎn)錄因子NF-кB調(diào)控的前炎癥因子的影響。如圖 4A、B所示,Rab7同樣抑制了TNF-α和 IL-1β的表達。與 IFN-β和 IP10的產(chǎn)生不同的是,Rab7突變后,IL-1β在poly I:C刺激24小時后表達最高。

3 討論

Rabs蛋白家族特征是具有與GDP/GTP的結(jié)合保守的“G domain”。在Rab7的相關(guān)研究中,Rab7的突變體Rab7T22N,即第22位的蘇氨酸(T)突變?yōu)樘於０?N),該突變體降低了與GDP/GTP的親和力,Rab7表現(xiàn)為功能喪失。Bucci Cecilia實驗室的研究表明,野生型 Rab7能夠與 GTP結(jié)合,而突變體Rab7T22N不能與GTP結(jié)合,因此Rab7T22N被稱為顯性失活體[12]。在我們的研究中,通過PCR定點突變法,也成功地將小鼠野生型Rab7(mRab7)突變?yōu)镽ab7T22N(tRab7),為后面的研究打下基礎(chǔ)。隨后,我們將突變質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞RAW264.7,Western blot的結(jié)果顯示出過表達狀態(tài),說明Rab7質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入并在細胞內(nèi)表達。

近年來,Rab7與信號轉(zhuǎn)導的關(guān)系是新的研究熱點。研究表明,PC12細胞中轉(zhuǎn)染Rab7T22N后使神經(jīng)生長因子受體TrkA聚集在內(nèi)體,并促進了NGF誘導的TrkA的信號轉(zhuǎn)導,比如ERK1/2的磷酸化水平增高、神經(jīng)元生長和GAP-43蛋白的表達[7]。然而關(guān)于Rab7與TLRs的轉(zhuǎn)運和信號轉(zhuǎn)導的研究甚少。我們以前的研究結(jié)果表明,Rab7的同源分子Rab7b能夠通過轉(zhuǎn)運TLR4受體到溶酶體降解從而負向調(diào)控了TLR4的信號轉(zhuǎn)導過程[13]。而 Rab家族的Rab10能夠通過促進TLR4轉(zhuǎn)運到細胞膜而促進了TLR4的信號轉(zhuǎn)導[14]。我們的研究結(jié)果顯示,過表達Rab7能夠抑制poly I:C誘導的細胞因子的表達,該研究為Rab7與TLR3的信號轉(zhuǎn)導打下基礎(chǔ)。

TLR3通過接頭分子TRIF一方面會活化轉(zhuǎn)錄因子NF-kB調(diào)控前炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β等的釋放;另一方面會活化轉(zhuǎn)錄因子IRF3,其主要調(diào)控Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)的產(chǎn)生[15]。趨化因子IP10病毒感染時增高,其產(chǎn)生受IFN的調(diào)控。在我們的實驗中檢測到,Rab7過表達后不僅抑制了IP10和IFN-β的表達,也抑制了前炎癥因子 TNF-α、IL-1β的產(chǎn)生。而 Rab7失活突變后逆轉(zhuǎn)了以上效應,說明Rab7發(fā)揮作用依賴于其GTP結(jié)合活性。poly I:C是有效的病毒dsRNA的模擬劑,我們的結(jié)果提示Rab7可能與病毒逃逸機體的免疫反應有關(guān),相關(guān)研究將會揭示病毒與免疫細胞的相互關(guān)系。

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