豬FcγRⅡB多種剪接異構體的基因克隆與序列分析①

張宜娜 劉肖萍 張志遠 段二珍 張繼希 周永輝 夏平安 崔保安

(河南農業大學牧醫工程學院獸醫免疫學實驗室,鄭州450002)

Fc受體是免疫細胞上一類能夠結合抗體Fc片段的受體,廣泛表達于免疫輔助細胞和效應細胞,介導免疫細胞與抗原-抗體復合物及其他細胞間的相互作用,觸發和調控機體多種免疫學效應,是機體體液免疫與細胞免疫間關鍵的聯系紐帶,在機體免疫防御中起著極其關鍵的作用[1]。

根據FcγR胞內區功能特征不同可將其分為激活型受體和抑制型受體兩類,二者共表達于巨噬細胞、單核細胞等免疫細胞表面,共同調節抗體對免疫細胞的活化作用,激活型受體的胞內區或者γ鏈含有基于酪氨酸的受體活化基序(ITAM),能激活免疫效應細胞,誘導多種免疫學效應[2-5]。FcγRⅡB是目前發現的唯一的抑制型受體,其胞內區含有基于酪氨酸的受體抑制基序(ITIM),通過免疫復合物與激活型受體交聯,抑制ITAM基序介導的細胞活化[6]。

人和哺乳動物的FcγR 主要有FcγRⅠ(CD64)、FcγRⅡ(CD32)和FcγRⅢ(CD16)3個亞群,都屬于 Ig超家族成員,每個亞群都存在幾種亞類和不同的RNA剪接異構體[7]。目前已發現人的FcγRⅡB通過信號肽、跨膜區和胞內區的選擇性剪接形成了五種轉錄體,鼠的FcγRⅡB通過胞內區的選擇性剪接形成了兩種轉錄體。Qiao等[8]克隆并鑒定了豬的FcγRⅡB 受體(swFcγRⅡB),劉玉松等[9]隨后發現其存在RNA剪接異構體FcγRⅡB1(GenBank accession No.FJ608551),與swFcγRⅡB受體相比,胞內區有57個堿基的插入。

本研究利用RT-PCR技術從豬肺巨噬細胞中擴增豬FcγRⅡB基因,并進行測序、序列分析,尋找豬FcγRⅡB受體基因是否存在其它的RNA剪接異構體。對所克隆基因的核苷酸及氨基酸序列進行分析比對,探明豬FcγRⅡB各轉錄體的選擇性剪接方式,為進一步研究豬FcγRⅡB多種轉錄體的生物學功能及其相互作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑 pTG19-T載體購自上海捷瑞生物工程有限公司,大腸桿菌DH5α由河南農業大學獸醫微生物研究室保存,Trizol LS Reagent、T4 DNA連接酶 、rTaq 酶、DNA marker DL2000、DNA marker DL15000、RT試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司,DNA膠回收純化試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司。

1.2 實驗動物 20頭大白豬購自河南省多個豬場。

1.3 RT-PCR引物設計 根據GenBank中已發表的豬IgGⅡB類Fc受體cDNA基因序列(DQ026064),利用Primer5.0軟件,設計一對可擴增豬FcγRⅡB基因完整ORF特異引物。引物序列如下:T24:5′-CAGAGGCAACCTGCGTAC-3′;T25:5′-CAAGTCCCAGGCAAGATAAT-3′。

1.4 豬肺巨噬細胞的分離 無菌采集豬的新鮮肺臟,按參考文獻[10]提供的方法分離豬肺巨噬細胞,并調整細胞濃度為6×106個/ml。

1.5 豬肺巨噬細胞總RNA的提取 取豬肺巨噬細胞250 μl,加入 750 μl的 Trizol裂解液,振搖混勻,室溫放置10分鐘加入氯仿200μl,室溫放置10分鐘,12 000 r/min,4℃離心15分鐘,取上清液,加入等體積的異丙醇,室溫放置15分鐘,以12 000 r/min,4℃離心15分鐘,棄上清,沉淀用75%乙醇洗滌,用濾紙吸干剩余的液體,加入15μl焦碳酸二乙酯(DEPC)滅菌水溶解,-80℃保存備用。

1.6 RT-PCR擴增豬FcγRⅡB受體基因 按照反轉錄試劑盒使用說明進行反轉錄。以反轉錄所獲取豬肺巨噬細胞cDNA為模板,以引物T24和T25擴增豬FcγRⅡB基因,PCR反應體系為 25μl。PCR反應條件:94℃預變性5分鐘;94℃45秒,58.6℃1分鐘,72℃1分鐘,共35個循環;72℃10分鐘;4℃保存。反應結束取6μl用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.7 目的基因的克隆與鑒定 按北京百泰克DNA膠回收試劑盒說明書純化回收PCR產物,并連接于pTG19-T載體中,連接產物按常規方法轉化DH5α感受態細胞[11],進行藍白斑篩選,挑選白斑接于含有氨芐青霉素的LB培養基,37℃培養過夜。取培養物提取質粒,進行酶切和PCR鑒定,篩選出陽性重組質粒,送上海尼桑生物技術有限公司測序。

1.8 豬FcγRⅡB編碼區cDNA序列分析 序列對比和翻譯使用DNAMAN軟件包進行,同源性檢索分別使用NCBI(National centre for Biotechnological Information)和 DDBJ(Dan Data Bank of Japan)提供的BLAST和FAST檢索和分析軟件進行。結構分析、信號肽和糖基化位點預測及其它序列分析使用CBS服務器提供的軟件包進行。

2 結果

2.1 目的基因的擴增 用RT-PCR法從豬肺巨噬細胞中擴增出大小不同的6個目的片段,經膠回收純化,連接,轉化,挑取陽性克隆提取質粒,用Bam HⅠ酶切,得到了與預期目標大小相符的兩個條帶,擴增結果及酶切鑒定見圖1、2。

2.2 序列測定與分析 將獲得的DH5α陽性克隆菌液送上海尼桑生物技術有限公司測序,通過DNAStar和Blast軟件分析表明,擴增得到的序列為豬FcγRⅡB基因序列。擴增的6個片段長度分別為1 005、945、948 、999、639 和 573 bp,經測序分析,完整的ORF長為951、891、894、948、639 和 519 bp。根據Fc受體命名規則,FcγRⅡB1-6基因分別命名為豬FcγRⅡB 轉錄體1、2、3、4、5和 6。這六個轉錄體是從不同個體豬體內提取出來的,其中轉錄體1和轉錄體3的提取頻率可達90%,而其他的只提取出過一次。另外轉錄體1和3以及轉錄體5和3均在同一豬體內也提取過,即在機體中有兩種或兩種以上的轉錄體同時存在,只是轉錄體1和3是優勢表達。經氨基酸序列比對分析,FcγRⅡB轉錄體1與本實驗室提交序列(FJ608551)ORF序列一致,轉錄體3與swFcγRⅡBORF大小一致,僅存在 4個氨基酸的變異(丙氨酸第11位,精氨酸第44位,酪氨酸第110位,半胱氨酸第246位)。擴增出的6個轉錄體與swFcγRⅡB相比,核酸同源性分別為:98.8%、99.1%、99.6%、98.2%、98.7%和 98.3%,氨基酸同源性分別為97.0%、97.6%、98.3%、96.3%、96.7%和95.4%。FcγRⅡB轉錄體1含有6個糖基化位點(NTT 、NFT 、NFS 、NQS 、NIT 、NHT),胞外區有 2個 Ig結構域(EC1、EC2),信號肽由45個氨基酸組成。轉錄體2也含有6個糖基化位點,胞外區2個Ig結構域,信號肽區域包含42個氨基酸,缺失第45位氨基酸(丙氨酸)。轉錄體3與4在糖基化位點和胞外區結構相同,信號肽區域包含45個氨基酸。轉錄體4與1相比,只在信號肽區包含42個氨基酸,缺失45為氨基酸。轉錄體5,6缺少3個糖基化位點(NFS、NQS和NIT),形成胞外區的第二個Ig結構域。FcγRⅡB轉錄體6缺失由23個氨基酸組成的跨膜區,為可溶性FcγⅡB受體。轉錄體2、3和5與轉錄體1相比胞內區有19個氨基酸的缺失,如圖3。

豬FcγRⅡB的氨基酸組成與人的有高度同源性與相似性。人FcγRⅡB轉錄體2,4與轉錄體1,3相比缺失了第46位氨基酸,同樣是一個丙氨酸,轉錄體2,3胞質尾區有19個氨基酸的缺失。有意義的是,豬FcγRⅡB與人的一樣,缺失丙氨酸的轉錄體信號肽都只有42個氨基酸,不缺失丙氨酸的轉錄體信號肽有45個氨基酸。比對豬FcγRⅡB轉錄體1～4與人FcγRⅡB轉錄體1～4的氨基酸同源性分別為61.7%、61.9%、62.0%和62.6%。

用DQ026064序列在GenBank中進行BLAST分析,在豬的染色體4上找到了豬FcγRⅡB相應的DNA序列(CU468575)。共有9個外顯子組成,長度分別為112、21、258、255、255、120、57、38 和90 bp。內含子以GT-AG的機制剪切。各轉錄體核苷酸序列與豬FcγⅡB DNA序列進行比對,轉錄體1由外顯子1,2,3,5,6,7,8,9組成,轉錄體2由外顯子1,2,4,5,6,8,9組成,轉錄體3由外顯子1,2,3,5,6,8,9組成,轉錄體4由外顯子1,2,4,5,6,7,8,9組成,轉錄體5由外顯子1,2,3,6,8,9組成,轉錄體6由外顯子1,2,3,8,9組成。外顯子3,4,5,6,7為選擇性剪接位點,外顯子3與外顯子4的選擇性剪接形成了各轉錄體間信號肽的差別,外顯子5編碼EC2結構域,外顯子6編碼跨膜區。各轉錄體的外顯子組成如圖4。

圖1 FcγRⅡB1-3 PCR擴增及重組質粒酶切鑒定圖Fig.1 A,B and C are PCR product and enzymes clipping graphs of FcγRⅡB1,FcγRⅡ B2 and FcγRⅡB3

圖2 FcγRⅡB4-6 PCR擴增及重組質粒酶切鑒定圖Fig.2 D,E and F are PCR product and enzymes clipping graphs of FcγRⅡB4,FcγR ⅡB5 and FcγRⅡB6

圖3 豬FcγRⅡB不同轉錄體之間氨基酸序列的比對Fig.3 Comparison of different porcine FcγRⅡB transcript variants amino acid sequences

圖4 豬FcγRⅡB各轉錄體的外顯子組成結構分析圖Fig.4 Construction analysis of exons of porcine FcγRⅡB transcript variants

3 討論

第一個被分離鑒定的豬FcγRⅡB基因序列是Qiao[8]所發表的DQ026064,ORF全長894 bp,為單次跨膜糖蛋白,胞外區包括45個氨基酸的信號肽和兩個Ig結構域(EC1:83個氨基酸,EC2:70個氨基酸),跨膜區和胞質尾區分別由23和50個氨基酸組成,胞質尾區包含一個ITIM抑制基序:ITYSLL。經生物學功能鑒定該受體蛋白能夠結合抗原-抗體復合物。隨后本實驗室發現該受體存在RNA剪接異構體(FJ608551),胞質尾區有19個氨基酸的插入,經生物學功能鑒定同樣能夠結合抗原-抗體復合物。為進一步研究豬FcγRⅡB是否存在其它的轉錄體,免疫細胞的選擇性表達機制,本研究根據DQ026064設計了一對特異性引物,對豬不同個體的肺泡巨噬細胞進行擴增,結果出現了與DQ026064和FJ608551不同的另外4個轉錄體,經氨基酸序列分析比對,我們發現轉錄體4和轉錄體1相比,信號肽部分有一個丙氨酸的缺失,轉錄體2和轉錄體3相比信號肽部分同樣有一個丙氨酸的缺失。豬FcγRⅡB轉錄體5和6是兩種新型的FcγRⅡB,其他物種中尚未發現有相似結構的FcγRⅡB。轉錄體5胞外區缺失了EC2結構域,只含有一個Ig結構域,轉錄體6缺失了EC2結構域和跨膜區及胞質尾區的27個氨基酸,是一個可溶性FcγRⅡB受體。由此我們推斷豬FcγRⅡB至少存在4個亞類。在多次的擴增試驗中,我們發現轉錄體1和轉錄體3的提取頻率可達90%,而其他的只提取出過一次,推測這兩種轉錄體的表達是豬FcγRⅡB的主要表達方式,而且在機體中有兩種或兩種以上的轉錄體同時存在。

可溶性FcγRⅡB被首次克隆鑒定是在小鼠體內[12],可溶性Fc受體的產生通過兩種方式:膜結合蛋白的裂解和缺失跨膜區外顯子的選擇性剪接[13],牛FcγRⅡB3缺失編碼跨膜區的外顯子120 bp[14],和豬FcγRⅡB轉錄體6同屬于RNA選擇性剪接可溶性Fc受體。可溶性Fc受體在體液中循環,結合免疫復合物干擾抗體的免疫學功能,還可以與細胞表面的配體結合發揮多種生物學效應,調節細胞的增殖,成熟或抗體的產生[15]。

DNA中內含子是以剪接供體位點GT或GC,受體位點AG為選擇性剪接位點[16]。在豬FcγRⅡB DNA序列中,內含子以GT-AG為選擇性剪接位點。豬FcγRⅡB DNA共有9個外顯子組成,其中外顯子1,2,8,9為6個轉錄體的共有序列,外顯子3,4的選擇性剪接造成了各轉錄體間信號肽的差異,外顯子5,6分別編碼了EC2結構域和跨膜區,外顯子7的選擇性剪接造成了各轉錄體間胞質尾區的不同,從豬FcγRⅡBDNA外顯子結構圖推斷,豬FcγRⅡB可能還存在其它的轉錄體形式。

目前各種物種的FcγRⅡB基因相繼克隆,基因外顯子組成及FcγRⅡB蛋白分子特征都有很大的相似之處,但RNA選擇性剪接機制,各轉錄體間的相互關系及每個外顯子的生物學功能等方面的研究還相對較少,這需要我們進一步的研究和探索。

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