慢性鼻竇炎伴鼻息肉與HLA-DPB1、DQB1基因相關性研究①

鄒 華 高 偉 田 鵬 付永貴 孫 雨

(中山大學孫逸仙紀念醫院耳鼻咽喉頭頸外科,廣州510120)

慢性鼻竇炎伴鼻息肉是耳鼻咽喉科常見病、多發病,其具體發病機理至今未明。目前認為慢性鼻竇炎伴鼻息肉是一個多因素、多基因相關性疾病。免疫因素和遺傳因素在其發生、發展和預后方面都有著重要的作用。人類白細胞抗原(Human Leukocyte Antigen,HLA)是人類免疫系統的重要組成部分,具有高度的多態性,是免疫遺傳學研究的重要組成部分。早期研究顯示HLA基因與鼻息肉發病有一定相關性[1]。本研究通過對廣東地區慢性鼻竇炎伴鼻息肉病例組及對照組的HLA-DPB1、DQB1的分型研究,初步探討慢性鼻竇炎伴鼻息肉在上述兩個位點的易感基因及保護性基因,以探討HLA與慢性鼻竇炎伴鼻息肉病因的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象和分組 慢性鼻竇炎伴鼻息肉組選取2009年8月至2009年12月在中山大學孫逸仙紀念醫院耳鼻咽喉科確診為慢性鼻竇炎伴鼻息肉的患者 46例,其中男 29例,女 17例,年齡(43.80±14.61)歲。診斷以Epos2007為標準,排除囊性纖維化及免疫缺陷性疾病。對照組為同科住院非鼻科疾病患者共50例,其中男24例,女26例,平均年齡為(48.96±16.38)歲。

1.2 實驗試劑 試劑盒:血液基因組DNA提取試劑盒購自美國Omega公司;質粒提取試劑盒購自美國Omega公司;測序試劑盒購自美國ABI公司;PCR產物純化試劑盒購自美國AXYGEN公司。其他試劑材料:10×PCR Buffer及Taq DNA聚合酶購自北京鼎國生物技術有限責任公司,dNTP購自美國Promega公司,PCR引物委托美國Invitrogen生命技術公司合成,核酸分子質量標準DL 2000 Marker購自大連寶生物公司(TaKaRa公司),大腸桿菌DH5a由中山大學生命科學院提供,pGEM-T-easy Vector載體購自Promega公司。測序使用美國應用生物系統公司3700基因分析儀。

1.3 實驗方法 所有實驗對象采肘正中靜脈血3 ml,用以提取基因組DNA。每樣品取0.25 ml血液,用OMEGA試劑盒提取樣品基因組DNA。采用以PCR-SBT為主的分型方法對HLA-DPB1、DQB1基因進行DNA序列測定和等位基因分型。DPBl和DQB1的序列特異性引物是參考Lin等[2]的方法設計合成的(表1)。對于不明確雜合子先進行克隆測序,再進行等位基因分型。

表1 HLA-DPB1,-DQB1 PCR擴增及測序引物序列Tab.1 The sequence of HLA-DPB1 and-DQB1 PCR amplification and sequencing primer

表2 DPB1和DQB1各等位基因在病例及對照組中的分布比較Tab.2 DPB1 and DQB1 allele distribution in CRSwNP patients and controls

1.4 統計學分析 應用SPSS 11.0軟件包對數據進行四格表 χ2檢驗,比較鼻息肉組與對照組DPBl及DQB1等位基因型頻率差異。計算優勢比(Odds Ratio,OR)和95%可信區間(95%Confidence Intervals,95%CI)得出等位基因頻率與慢性鼻竇炎伴鼻息肉的相關性。

2 結果

2.1 DPB1*040101等位基因僅出現在病例組。

2.2 DPB1*0502-030101和DQB1*0202-020101兩種等位基因頻率在對照組明顯高于病例組,差異有統計學意義。

2.3 DQB1*050301在病例組中的頻率高于在對照組,但差異無統計學意義。DPBl及DQB1位點各等位基因分布見表2。

3 討論

慢性鼻竇炎伴鼻息肉發病率較高,正常人群的患病率約為4%[3],該病不僅嚴重影響患者的生活質量,還造成巨大的社會經濟負擔。據美國的評估數據,每年在鼻竇炎的直接開支總額達到57.8億美元[4]。然而,目前我們對慢性鼻竇炎的病因及發病機制尚不清楚。近年對HLA與疾病相關性研究取得了很大進展,HLA與鼻息肉發病相關性研究已經發現許多易感等位基因及保護性基因[5-11]。鼻息肉具有遺傳性,在廣東地區不僅有家族聚集性,而且通過我們對廣東地區人群HLA-DPB1、DQB1等位基因的檢測,發現某些等位基因有明顯的疾病易感性或保護性。廣東人群中慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者與HLA-DPB1、DQB1相存在明顯的相關性。

我們在慢性鼻竇炎伴鼻息肉病例組及對照組,共檢出HLA-DPB1等位基因12種,其中病例組11種,對照組9種。頻率最高的等位基因為HLA-DPB1*0501,在病例組和對照組中的比例分別為50%和48%。HLA-DQB1基因分型共發現16種DQB1等位基因,實驗組11種,對照組15種。其中幾種常見的頻率為HLA-DQB1*0301,0602,0502,0503。國內孫筱放等[12]采用PCR/SSO方法,隨機選擇102名廣東籍漢族人進行了HLA-II基因的DNA分型,探討中國廣東漢族群體HLA-Ⅱ類基因多態性,結果檢測出12種DQB1和12種DPB1基因,其中頻率最高的為HLA-DQB1*0301(基因頻率28.6%)和HLA-DPB1*0501(基因頻率37.4%)。此與本文研究結果基本一致。

我們通過比較兩組檢出的HLA-DPB1各等位基因頻率,共發現有兩個等位基因頻率存在統計學差異,分別為HLA-DPB1*0502-030101和HLA-DPB1*040101,其中HLA-DPB1*0502-030101(OR=0.366,95%CI:0.137～0.981)等位基因頻率在對照組增高,考慮為慢性鼻竇炎伴鼻息肉的保護性因素;而HLADPB1*040101僅在病例組中檢出,無法計算OR值,但在兩組間的比較中有統計學差異,推斷可能為慢性鼻竇炎伴鼻息肉的易感因素。以往沒有HLADPB1與鼻息肉的相關性研究,但有學者研究了韓國人群HLA-DPB1與哮喘伴或不伴阿司匹林敏感的相關性,發現HLA-DPB1*0301是哮喘伴阿司匹林耐受不良的一個易感標志[13],而在哮喘不伴有阿司匹林耐受不良的人群中該基因頻率較低,該結果同以往的研究結果顯示,HLA-DPB1*0301可能參與哮喘伴阿司匹林耐受不良的發病過程。同時,該研究還發現,HLA-DPB1*0401在哮喘伴或不伴阿司匹林耐受的患者中其頻率降低了,表明該等位基因又是哮喘發病的一種保護因素。同本文的研究結果均顯示HLA-DPB1*0301及HLA-DPB1*0401同鼻息肉、哮喘及阿司匹林敏感密切相關。但由于未能完全分型,HLA-DPB1*030101與HLA-DPB1*0502尚不能完全區分,可能在這個共同型別中,兩種等位基因差異的部分對哮喘、鼻息肉及阿司匹林不耐受的發病發揮重要的作用。需要進一步的實驗來探討。

本研究發現HLA-DQB1*0202-020101在對照組出現頻率較病例組高,兩組間差異有統計學意義,且其優勢比OR=0.381(95%CI為 0.159～0.914),提示其為慢性鼻竇炎伴鼻息肉的保護性因素。另外,病例組中HLA-DQB1*050301的頻率明顯高于對照組,提示其可能為慢性鼻竇炎伴鼻息肉的易感因素。Molnar-Gabor等[6]研究發現,攜帶DR7連鎖DQA1*0201和DQB1*0202的人群,發生鼻息肉的OR值增加了,并且在鼻息肉伴阿司匹林敏感的患者中DR7連鎖DQA1*0201和DQB1*0202頻率增加,且兩者具有統計學意義,此結果與本文研究結果顯示,HLA-DQB1*0202與鼻息肉發生及阿司匹林敏感的發生密切相關。但本研究提示HLA-DQB1*0202為慢性鼻竇炎伴鼻息肉的保護性因素,似乎與該結果相反,此尚需要進一步實驗來探討。

另外,Molnar-Gabor等[6]研究顯示HLA-DQB1*0301在慢性鼻竇炎伴鼻息肉中頻率較低(OR=0.57),對鼻息肉發病起保護性作用,有統計學意義。本文研究結果發現,對照組中HLA-DQB1*0301的頻率較正常組高,提示其有增高趨勢,可能對鼻息肉發病起保護性因素,但可能因為樣本量太小,結果尚無統計學意義,需進一步驗證。

總的來說,本研究得出結果為DPB1*040101僅在病例組中出現,DQB1*050301在病例組出頻率較對照組高,考慮兩者為廣東地區慢性鼻竇炎伴鼻息肉發病的易感基因。DPB1*0502-030101和DQB1*0202-020101在病例組中頻率較低,提示在廣東地區慢性鼻竇炎伴鼻息肉發病中具有保護作用。目前具體這些等位基因影響鼻息肉發病的機制我們尚不清楚,但通過對HLA基因不斷深入的研究,將闡明HLA基因在鼻息肉發病及診斷中的作用,最終可通過干預易感個體中免疫細胞表面HLA分子的表達,阻斷自身抗原遞呈的作用,為鼻息肉的預防及治療開辟新途徑。

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