四川和河南烤煙葉片番茄紅素β環化酶基因的表達分析

賈 峰，魏慶華，劉衛群,2

(1.河南農業大學，國家煙草栽培生理生化重點實驗室，鄭州 450002；2.河南農業大學生命科學學院，鄭州 450002)

類胡蘿卜素（Carotenoids）是廣泛存在于自然界一類重要天然色素的總稱，主要由直鏈番茄紅素在一端或兩端環化后形成[1-2]。植物中起環化作用的酶主要有番茄紅素β環化酶（lycopene cyclase，Lycβ）和番茄紅素ε環化酶（Lyc-ε）2種。Lyc-β酶的主要功能是催化番茄紅素直鏈的一端或兩端，形成β環化，從而形成β玉米胡蘿卜素、γ胡蘿卜素和無所不在的β胡蘿卜素；Lyc-β和Lyc-ε酶共同催化形成常見的α胡蘿卜素；而Lyc-ε酶雖然可以單獨催化形成ε胡蘿卜素，但在植物體內鮮見[3-4]。因此，Lyc-β酶是生產類胡蘿卜素的關鍵酶（基因）。

類胡蘿卜素是烤煙煙葉主要致香成分的前體物[5-9]，與烤后煙葉中性致香成分含量呈顯著正相關關系[10]。最近的研究表明，不同生態區煙草中類胡蘿卜素含量差異很大[11]。將不同生態區烤煙煙葉中類胡蘿卜素積累與Lyc-β基因轉錄水平直接聯系的報道很少。為此，筆者采用半定量RT-PCR并結合Northern雜交的方法研究了四川會理（清甜香型煙葉）與河南寶豐（濃香型煙葉）2個不同生態區現蕾期煙葉中Lyc-β基因表達的差異，旨在從分子水平揭示其含量差異的原因，為深入分析不同生態區煙葉類胡蘿卜素的降解產物含量差異提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

取烤煙（Nicotiana tabacumL.）品種云煙85現蕾期上部煙葉為試驗材料，分別于 2008—2009年在四川會理和河南寶豐進行大田試驗。

1.2 RNA提取、RT-PCR擴增和Northern雜交

煙葉總RNA 的提取和cDNA第一鏈的合成以及半定量 RT-PCR體系參照文獻[12]的方法進行。煙草Lyc-β(GenBank 登錄號為 X81787.1)正向引物序列為：5' CAA GAA AGA ATG GTG GCT 3'，反向引物序列為：5' CAG GCG AGA TGA CAA GAA 3'（擴增片段長度為432 bp）；肌動蛋白基因（Actin）(GenBank登錄號為 EU938079)的引物設計和擴增參考文獻[12]的方法進行。以肌動蛋白基因的相對含量作為內參，按Actin擴增后灰度分析的結果添加模板量。用UVBand紫外-可見分光光度計計算機軟件對電泳條帶進行灰度分析，以調整Lyc-β基因PCR 擴增時的模板量。PCR擴增條件同上，取等體積的PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠（EB）染色后，采用 UVBand紫外-可見分光光度計計算機軟件對基因相對表達量進行分析。Northern雜交按照文獻[13]的方法進行，探針是DIG DNA Labeling Kit（Roche）標記的Lyc-β基因RT-PCR產物。

1.3 類胡蘿卜素檢測及數據處理

根據GB/T 5009.83—2003標準，分別取四川和河南烤煙上部煙葉的殺青烘干樣品，送云南省煙草農業科學研究院分析測試中心檢測類胡蘿卜素含量，4次重復。試驗數據采用Student’st檢驗（P≤0.05和P≤0.01）分析。

2 結 果

2.1 RNA電泳

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測煙葉總RNA的結果(圖1)表明，28 S、18 S、5 S三條帶中28 S和18 S帶比較亮，說明RNA樣品并未發生降解；A260/A280在1.90～2.00之間，說明RNA樣品的純度高，可用于cDNA的合成。

圖1 煙葉總RNA的電泳檢測Fig.1 Total RNA separated on agarose gel

2.2 Lyc-β引物和內參Actin引物RT-PCR結果

從圖2可以看出，Lyc-β基因PCR擴增產物的條帶比較清晰，基本上沒有拖尾現象。兩地區煙葉的Actin擴增產物基本一致，而四川煙葉中Lyc-β基因擴增的條帶亮度大于河南的，說明在現蕾期四川煙葉中Lyc-β基因表達水平高于河南的。

圖2 Lyc-β基因的半定量RT-PCR結果Fig.2 Semi-quantitative RT-PCR analysis of Lyc-β

2.3 Lyc-β基因表達的Northern雜交結果

Northern雜交結果(圖3)顯示，在兩個泳道RNA量一致的情況下，煙葉的雜交帶四川比河南的亮，表明四川煙葉中Lyc-β基因表達水平高于河南的。

圖3 Lyc-β表達的Northern雜交分析Fig.3 Northern blotting analysis of the Lyc-β expression

2.4 上部煙葉類胡蘿卜素含量變化

通過檢測分析發現，現蕾期烤煙上部葉中葉黃素含量四川為（311.7±15.81）μg/g（DW），河南煙葉中的為（264.15±14.00）μg/g（DW）；四川和河南烤煙中β胡蘿卜素的含量分別為（104.93±4.62） μg/g（DW）和（69.53±3.40）μg/g（DW）；Student’st檢驗結果表明，葉黃素和β-胡蘿卜素含量四川煙葉極顯著地（P≤0.01）高于河南的。這與基因Lyc-β的半定量RT-PCR和Northern雜交的結果相符。

3 討 論

煙草番茄紅素β環化酶的基因序列是 1996年由 Cunningham 等[7]首次克隆和鑒定出來的，隨后在番木瓜和馬鈴薯中鑒定出有2種Lyc-β基因，一種在光合組織中表達，而另一種在花和果實中特異表達[14-15]。本研究據Cunningham等在GenBank中發表的煙草中類胡蘿卜素合成的關鍵酶Lyc-β基因的序列設計引物，用半定量RT-PCR和Northern雜交技術分析了四川和河南烤煙現蕾期Lyc-β基因的表達量，結果表明，四川煙葉現蕾期Lyc-β基因表達水平明顯高于河南（圖2和圖3）；四川同期的殺青樣品檢測表明類胡蘿卜素（包括葉黃素和β-胡蘿卜素）含量也明顯高于河南（圖4）。這表明煙葉類胡蘿卜素含量和番茄紅素β環化酶基因表達量的變化趨勢是一致的。由此Lyc-β基因可以作為類胡蘿卜素含量預測的分子指標，通過測定烤煙生長期Lyc-β基因的轉錄水平來預測煙葉成熟期類胡蘿卜素含量。

2000年，Ye等[16]把Lyc-β基因導入水稻，能夠使本來不含類胡蘿卜素的水稻胚乳中合成了4種類胡蘿卜素。而Dharmapuri等[17]在2002年通過基因工程手段把Lyc-β基因轉入番茄，使番茄果實中的類胡蘿卜素增加近 10倍，表明Lyc-β基因的表達升高可以顯著提高類胡蘿卜素的生物合成。因此，可以通過基因工程的手段來提高煙葉中類胡蘿卜素的含量，并且豐富煙草種質資源。

一般認為類胡蘿卜素的合成與溫度、光照和濕度等有關，這些環境因子對植物體內類胡蘿卜素合成基因的表達有明顯影響[18]，然而環境因子包括了溫度、光照、濕度、空氣、土壤等因子，其中是什么因子對Lyc-β基因的表達影響較大？是通過何種途徑影響的？需要進一步深入研究，才能夠更加準確地實現通過對環境因子的調控，達到調控類胡蘿卜素合成的過程。

4 小 結

通過RT-PCR擴增和Northern雜交檢測發現四川和河南煙葉中Lyc-β基因表達量的結果基本一致，在現蕾期四川煙葉中Lyc-β基因表達水平明顯高于河南煙葉的。在現蕾期四川烤煙上部葉中葉黃素的含量顯著高于河南的。這與基因Lyc-β的半定量RT-PCR和Northern雜交的結果相互統一。因此，四川和河南兩個生態區煙葉中類胡蘿卜素含量的差異可能與Lyc-β基因的表達差異有關，為進一步深入揭示不同生態對烤煙香氣風格的形成具有一定的理論意義。

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