芍藥苷減輕小鼠LPS性急性肺損傷的作用機制研究*

張 斌， 李紅梅， 王 媛， 王發強， 王一陽， 呂秀秀， 戚仁斌， 陸大祥， 王華東

(1中山大學附屬第五醫院胸心外科，廣東 珠海 519000;2暨南大學醫學院病理生理學系，國家中醫藥管理局病理生理學重點實驗室，廣東 廣州 510632)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是以中性粒細胞浸潤的炎癥反應、微血管和肺泡上皮彌漫性損傷、肺水腫及肺間質纖維化等為病理特征的一種臨床綜合征，嚴重者即為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，可由創傷、肺炎和膿毒癥等引起［1，2］。文獻報道，高達40%的膿毒癥患者伴發ALI/ARDS［3］;膿毒癥的重要致病因子，革蘭氏陰性細菌細胞壁的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，可通過多種途徑導致 ALI［4，5］;ALI/ARDS 是膿毒癥患者死亡的重要原因［6］。因此，尋找有效策略防治膿毒癥相關性ALI/ARDS和LPS誘導ALI對膿毒癥的治療具有重要臨床意義，一直是人們高度關注的研究領域［7］。

我們前期研究發現，芍藥苷(paeoniflorin，Pae)能顯著降低內毒素血癥小鼠的死亡率，抑制LPS誘導的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素 -1β(interleukin-1β，IL-1β)的產生，促進抗炎因子IL-10的表達，減輕腹腔注射LPS 誘導 ALI［8］。隨后，Zhou 等［9］的研究也進一步證實Pae能減輕氣道滴注LPS引起的ALI。然而，Pae減輕LPS誘導ALI的機制尚缺乏充分研究。研究表明，炎癥細胞因子、中性粒細胞與胞漿型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2，cPLA2)在腹腔或靜脈注射LPS誘導的 ALI的發病機制中發揮重要作用［2，10-13］，因此，本研究旨在觀察 Pae 對 LPS 攻擊小鼠肺中性粒細胞聚集及cPLA2活化的影響，以進一步闡明Pae減輕內毒素性肺損傷的作用機制。

材料和方法

1 動物

清潔級雄性 BALB/c小鼠，6-8周齡，體重21-23 g，購自廣東省實驗動物中心，合格證號為SCXK(粵)2008-0002。小鼠分籠飼養，自由飲水進食，實驗前置實驗環境中適應3-4 d，實驗環境溫度控制在(24±2)℃，相對濕度為60%-80%。小鼠處理符合暨南大學實驗動物管理的相關規定。

2 主要試劑與儀器

2.1 主要試劑 LPS(大腸桿菌O55∶B5)購自Sigma，芍藥苷(Pae)購自廣東省藥品檢驗所。小鼠抗小鼠髓過氧化物酶 (myeloperoxidase，MPO)單克隆抗體購自 R＆D;兔抗小鼠甘油醛 -3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自 Cell Signaling Technology;兔抗小鼠cPLA2、磷酸化的胞漿型磷脂酶A2(phospho-cPLA2，Ser505)抗體購自Cell Signaling Technology;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ⅱ抗和山羊抗小鼠Ⅱ抗購自北京鼎國昌盛生物科技有限責任公司。BCA-100蛋白定量試劑盒購自上海申能博彩生物公司。

2.2 主要儀器 Western blotting裝置(Bio-Rad);BX40型光學顯微鏡(Olympus)。

3 方法

3.1 實驗分組及模型建立 將雄性BALB/c小鼠隨機分為4組:對照組(control)、(LPS)組、Pae+LPS組(Pae+LPS)、Pae組(Pae)。分別以雙蒸水(0.1 mL/10 g)、Pae(20 mg/kg，0.1 mL/10g)灌胃，1 次/d，連續3 d，第3 d灌胃后1 h，腹腔注射生理鹽水［normal saline(NS)，0.2 mL/10 g］或 LPS(20 mg/kg，0.2 mL/10 g)。

3.2 肺組織病理學檢查 腹腔注射NS或LPS后12 h處死小鼠，開胸取左肺，固定于4%甲醛溶液中，隨后進行石蠟切片及常規HE染色，光學顯微鏡下觀察肺組織病理學改變。由同一個實驗者在光鏡下觀察以下組織學特征，根據Su等［14］提出的評估肺病理損傷方法，將肺中性粒細胞浸潤和肺出血分為4級，0:正常;1:25%的視野有損傷;2:50%的視野有損傷;3:75%的視野有損傷;4:彌漫性肺損傷。肺中性粒細胞浸潤(neutrophil infiltration)和肺出血(hemorrhage)評分最終結果以平均秩(mean rank)表示。

3.3 蛋白免疫印跡法檢測肺組織 MPO、cPLA2及phospho-cPLA2的含量 腹腔注射NS或LPS后12 h處死小鼠，開胸取右肺，冰生理鹽水(4℃)沖洗，濾紙吸干，加入0.5 mL的RIPA裂解液(含終濃度為1 mmoL/L的PMSF)，充分勻漿，冰面靜置30 min，13200 r/min離心30 min(4℃)。BCA-100蛋白定量試劑盒檢測肺組織勻漿液中總蛋白含量。按每個泳道孔加入70 μg蛋白樣品進行10%丙烯酰胺 SDS-PAGE凝膠電泳。Bio-Rad半干轉印儀15 V恒壓轉印 18 min至硝酸纖維素膜上。TBST配制的5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜。分別加入1∶1000稀釋的小鼠抗小鼠MPO、兔抗小鼠cPLA2和phospho-cPLA2Ⅰ抗液，以GAPDH為內參照，4℃過夜孵育。加1∶4000稀釋的辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠/兔Ⅱ抗孵育液，室溫孵育1 h?；瘜W發光法檢測抗原抗體復合物含量，BI2000軟件分析蛋白條帶的積分吸光度值，以MPO/GAPDH和phosphocPLA2/cPLA2積分吸光度比值分析結果。

4 統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件分析。計量資料采用均數±標準誤(E)表示，多組間比較用單因素方差分析ANOVA(SNK法)。等級資料用平均秩表示，兩獨立樣本比較采用Wilcoxon秩和檢驗。

結 果

1 肺組織病理學改變

光學顯微鏡下可見，LPS注射12 h，肺泡間隔明顯增厚，大量炎癥細胞浸潤，明顯肺出血及肺水腫;Pae+LPS組肺組織炎癥細胞浸潤，出血明顯輕于LPS組;空白對照組及Pae組肺組織結構完整，無出血、水腫，見圖1。

Figure 1.Representative photomicrograph of lung from mice 12 h after LPS or normal saline injection in control(A)，LPS(B)，Pae+LPS(C)，Pae(D)groups.The lung histological sections were stained with hematoxylin-eosin.Pae:paeoniflorin.Scale bars represent 50 μm.圖1 腹腔注射LPS或生理鹽水后12 h各組小鼠肺組織形態學改變

2 肺組織形態學評分

如圖2所示，LPS注射12 h后，LPS組中性粒細胞浸潤和出血顯著增多;Pae+LPS組肺組織中性粒細胞浸潤(4.75 vs 10.60)和出血(4.63 vs 10.80)評分的平均秩顯著低于LPS組(P＜0.01)。

Figure 2.Histological scores(neutrophil infiltration and hemorrhage)of lung from mice 12 h after LPS or normal saline administration in LPS and Pae+ LPS groups.Pae:paeoniflorin.Values are presented as mean rank.n=8.▲▲P＜ 0.01 vs LPS group.圖2 腹腔注射LPS或生理鹽水后12 h小鼠肺組織形態學評分

3 Pae對LPS處理小鼠肺組織MPO含量的影響

如圖3所示，小鼠腹腔注射LPS 12 h后，與對照組相比，LPS組肺組織 MPO含量明顯增加(P＜0.05);事先給予Pae灌胃能顯著抑制LPS引起的小鼠肺組織MPO含量的增加(P＜0.05)。Pae組與正常對照組相比，肺組織MPO水平未見顯著差異。

Figure 3.Effect of Pae on MPO content in lung tissues 12 h after LPS administration.E.n=6.*P＜0.05 vs control group;▲P＜ 0.05 vs LPS group.圖3 Pae對LPS處理小鼠肺組織MPO含量的影響

4 Pae對LPS處理小鼠肺組織cPLA2磷酸化水平的影響

如圖4所示，腹腔注射LPS 12h后，肺組織中磷酸化cPLA2水平明顯高于正常對照組(P＜0.05)，事先給予Pae能顯著抑制LPS引起的cPLA2的磷酸化(P＜0.05)。Pae組與正常對照組相比，肺組織磷酸化cPLA水平未見明顯差異。

Figure 4.Effect of Pae on phospho-cPLA2protein expression in lung tissues.E.n=6.*P＜0.05 vs control group;▲P＜ 0.05 vs LPS group.圖4 Pae對LPS處理小鼠肺組織磷酸化cPLA2含量的影響

討 論

本研究中，我們首先觀察小鼠腹腔注射 LPS 12 h后肺組織形態學改變。光學顯微鏡下可見，LPS組肺組織損傷明顯，肺泡間隔明顯增厚，大量炎癥細胞浸潤，肺出血及肺水腫明顯;預先給予芍藥苷灌胃，可明顯減輕LPS誘導的肺組織損傷，減少肺組織炎癥細胞浸潤、肺出血及肺水腫等。這些結果表明，Pae可顯著減輕腹腔注射內毒素引起的ALI，進一步證實了我們先前報道的結果［8］。

Uchiba等［10］發現，靜脈注射LPS 30 min后大鼠肺組織中即出現大量中性粒細胞聚集，隨后肺血管通透性明顯增加;用氨甲喋呤減少大鼠血中白細胞后，LPS誘導的肺血管損傷則明顯減輕。Abraham等［11］進一步研究發現，用環磷酰胺或中性粒細胞抗體減少中性粒細胞后，腹腔注射LPS誘導的小鼠肺水腫則明顯減輕，LPS誘導的肺組織轉錄因子核因子-kappa B活化被明顯抑制，IL-1β等炎癥細胞因子的表達明顯減少。這些結果說明，中性粒細胞在腹腔或靜脈注射LPS誘導的肺部炎癥反應和急性肺損傷的啟動環節中發揮重要作用。本研究發現，Pae預處理能明顯減少LPS攻擊小鼠肺組織中性粒細胞浸潤，表明抑制中性粒細胞向肺組織浸潤可能是Pae防止內毒素性ALI的機制之一。

為了進一步驗證Pae防止內毒素性ALI的上述機制，我們采用Western blotting檢測肺組織中MPO的含量，結果發現腹腔注射LPS明顯增加了小鼠肺組織MPO水平，Pae預處理可顯著降低LPS處理小鼠肺組織中MPO含量。MPO是一種高表達于中性粒細胞的蛋白酶，是中性粒細胞浸潤的主要標記物［15］。上述結果進一步證實抑制中性粒細胞向肺組織浸潤是Pae防止內毒素性ALI的重要機制。新近有研究表明，MPO缺乏可減輕 LPS誘導的肺損傷［15］，我們研究發現，Pae能減少LPS處理小鼠肺組織中MPO的含量，提示減少肺組織中MPO的水平也可能參與了Pae防止內毒素性ALI的機制。然而，Pae通過何種機制減少LPS誘導的中性粒細胞向肺組織浸潤，尚需進一步研究。Calkins等［16］研究發現，TNF受體p55基因敲除小鼠受到腹腔注射LPS攻擊后，肺組織趨化因子的產生和中心粒細胞浸潤程度明顯低于野生型小鼠，說明TNF介導了腹腔注射LPS誘導的肺組織中性粒細胞浸潤。我們先前的研究發現Pae可抑制 LPS誘導 TNF的產生［8］。因此，Pae可能通過抑制TNF的表達減少LPS誘導的中性粒細胞向肺組織浸潤。

另一方面，Nagase 等［13］研究證實，cPLA2是內毒素血癥誘導ALI的關鍵介質，抑制cPLA2的活化能顯著抑制LPS誘導的ALI。cPLA2催化中心連接區域的Ser505位點被磷酸化后激活，形成具有酶催化活性的cPLA2(phospho-cPLA2)，phospho-cPLA2通過催化細胞膜磷脂產生花生四烯酸 (araehidonieaeid，AA)和血小板活化因子，參與LPS誘導的ALI［13，17，18］。為了進一步闡明 Pae 減輕 LPS 性 ALI的作用機制，我們采用蛋白免疫印跡法檢測肺組織中phospho-cPLA2(Ser505)的表達。結果表明，內毒素血癥小鼠肺組織中磷酸化cPLA2水平顯著增高，芍藥苷可顯著降低內毒素血癥小鼠肺組織cPLA2的磷酸化。這些結果提示，Pae預防內毒素性肺損傷的機制與其抑制cPLA2的磷酸化有關。

綜上所述，Pae能明顯減輕腹腔注射LPS誘導的ALI，其作用機制與減少肺組織中性粒細胞浸潤、MPO含量及抑制cPLA2活化有關。本研究發現Pae能抑制LPS攻擊小鼠肺組織中cPLA2的活化，從一個新的角度闡明了Pae防治LPS性急性肺損傷的作用機制，為Pae用于膿毒癥性肺損傷的治療提供有力的實驗依據。

［1］Matthay MA，Zimmerman GA，Esmon C，et al.Future research directions in acute lung injury:summary of a National Heart，Lung，and Blood Institute Working Group［J］.Am J Respir Crit Care Med，2003，167(7):1027-1035.

［2］Tsushima K，King LS，Aggarwal NR，et al.Acute lung injury review ［J］.Intern Med，2009，48(9):621-630.

［3］Hudson LD，Milberg JA，Anardi D，et al.Clinical risks for development of the acute respiratory distress syndrome［J］.Am J Respir Crit Care Med，1995，151(2 Pt 1):293-301.

［4］Chen H，Bai C，Wang X.The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine［J］.Expert Rev Respir Med，2010，4(6):773-783.

［5］Togbe D，Schnyder-Candrian S，Schnyder B，et al.Toll-like receptor and tumour necrosis factor dependent endotoxin-induced acute lung injury ［J］.Int J Exp Pathol，2007，88(6):387-391.

［6］Sheu CC，Gong MN，Zhai R，et al.Clinical characteristics and outcomes of sepsis-related vs non-sepsis-related ARDS ［J］.Chest，2010，138(3):559-567.

［7］Varisco BM.The pharmacology of acute lung injury in sepsis［J］.Adv Pharmacol Sci(Epub 2011 Jun 28).

［8］Cao WJ，Zhang W，Liu JJ，et al.Paeoniflorin improves survival in LPS-challenged mice through the suppression of TNF-α and IL-1β release and augmentation of IL-10 production［J］.Int Immunopharmacol，2011，11(2):172-178.

［9］Zhou H，Bian D，Jiao X，et al.Paeoniflorin protects against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice by alleviating inflammatory cell infiltration and microvascular permeability ［J］.Inflamm Res，2011，60(10):981-990.

［10］Uchiba M，Okajima K，Murakami K，et al.Endotoxininduced pulmonary vascular injury is mainly mediated by activated neutrophils in rats［J］.Thromb Res，1995，78(2):117-125.

［11］Abraham E，Carmody A，Shenkar R，et al.Neutrophilsas early immunologic effectors in hemorrhage-or endotoxemia-induced acute lung injury［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2000，279(6):L1137-L1145.

［12］Arndt PG，Strahan B，Wang Y，et al.Leukocyte ADAM17 regulates acute pulmonary inflammation［J］.PLoS One，2011，6(5):e19938.

［13］Nagase T，Uozumi N，Ishii S，et al.Acute lung injury by sepsis and acid aspiration:a key role for cytosolic phospholipase A2［J］.Nat Immunol，2000，1(1):42-46.

［14］Su X，Bai CX，Hong QY，et al.Effect of continuous hemofiltration on hemodynamics，lung inflammation and pulmonary edema in a canine model of acute lung injury［J］.Intensive Care Med，2003，29(11):2034-2042.

［15］Haegens A，Heeringa P，van Suylen RJ，et al.Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production ［J］.J Immunol，2009，182(12):7990-7996.

［16］Calkins CM，Heimbach JK，Bensard DD，et al.TNF receptor I mediates chemokine production and neutrophil accumulation in the lung following systemic lipopolysaccharide［J］.J Surg Res，2001，101(2):232-237.

［17］Nagase T，Uozumi N，Aoki-Nagase T，et al.A potent inhibitor of cytosolic phospholipase A2，arachidonyl trifluoromethyl ketone，attenuates LPS-induced lung injury in mice ［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2003，284(5):L720-L726.

［18］Zhang HQ，Wang HD，Lu DX，et al.Berberine inhibits cytosolic phospholipase A2and protects against LPS-induced lung injury and lethality independent of the α2-adrenergic receptor in mice［J］.Shock，2008，29(5):617-622.